端粒功能异常诱导的DNA损伤反应及其在肿瘤发生中的作用与分子机制

【摘要】： 国内外研究现状: 端粒是位于真核细胞线性染色体末端,由重复DNA序列和端粒相关蛋白组成的特殊结构,其主要功能防止染色体末端被化学修饰或核酶降解,阻止染色体末端被识别为损伤的DNA而诱导DNA损伤反应和异常的DNA修复,防止染色体端-端融合、重组和染色体丢失。端粒结构和功能的改变与衰老、遗传病和肿瘤等密切相关,因而对调控端粒结构和功能的分子的研究成为近年来的研究热点。 端粒结构与功能的维持依赖于端粒的相关结合蛋白,其中端粒保护蛋白的作用尤为重要。端粒保护蛋白主要由六个核心蛋白组成:Pot1, TRF1, TRF2, TIN2, Rap1和TPP1,其中TRF1、TRF2结合于端粒双链DNA,Pot1识别并结合端粒单链DNA,而TPP1与Pot1相互作用,通过Tin2与TRF1、TRF2、Rap1连接共同形成端粒保护蛋白复合体(Shelterin),在端粒独特性“T”帽状结构的形成、维护端粒DNA免遭损害等方面发挥重要作用。 TPP1于2004年由3个独立实验发现,在端粒保护蛋白复合体的形成过程中起关键作用,并可通过其寡核苷酸结合域(OB fold)与端粒酶结合,调节端粒酶活性。然而,TPP1在保护端粒末端不被识别为断裂的双链DNA(Double Strand Breaks, DSBs),抑制DNA损伤反应(DNA Damage Response, DDR)及其启动的信号转导作用通路,维持染色体稳定性和抑制肿瘤形成等方面的功能,目前尚不清楚。 研究目的: 探讨抑制TPP1表达对端粒保护蛋白Pot1表达和定位、端粒功能、染色体的稳定性、以及肿瘤形成等影响,并探讨其可能信号转导机制。 研究内容和方法: 1. shTPP1的构建:体外构建靶向端粒保护蛋白TPP1的逆转录病毒介导的shRNA表达载体shTPP1,与表达外源性TPP1的质粒共同转染293T细胞,Western Blot检测shTPP1抑制外源性TPP1蛋白表达;RT-PCR检测shTPP1抑制小鼠胚胎成纤维细胞内源性TPP1在转录水平mRNA的表达。 2. shTPP1抑制TPP1表达对Pot1表达及在端粒上的定位的影响:将shTPP1质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)后,再转染表达外源性Pot1a或Pot1b的质粒DNA。采用Western Blot检测外源性Pot1a和Pot1b在抑制TPP1表达的MEF中的蛋白水平;端粒肽核酸-荧光原位杂交法(PNA-FISH)检测抑制TPP1表达后对外源性Pot1a和Pot1b在端粒上定位的影响。 3. TPP1表达缺失对端粒末端保护功能的影响:通过端粒末端脱氧尿嘧啶转移酶法(TdT-FITC)检测缺失TPP1对染色体末端保护功能产生的影响。 4. TPP1表达缺失在诱导端粒DNA损伤反应(DDR)中的作用:通过免疫荧光/端粒肽核酸荧光原位杂交法(IF/PNA-FISH)分别检测ATM+/+和ATM-/-细胞缺失TPP1表达后所诱导的端粒DNA损伤反应,由此形成的端粒功能障碍诱导损伤灶(TIF),同时通过Western Blot检测ATM+/+和ATM-/-细胞中端粒损伤标志物γ-H2AX的磷酸化水平。 5. ATM-p53信号转导机制在TPP1表达缺失诱导端粒DDR中的作用:采用细胞生长曲线和BrdU掺入法检测shTPP1转染后的原代培养细胞(ATM+/+,p53+/+)的增殖能力,细胞衰老相关β-gal染色实验检测抑制TPP1表达后引起的细胞衰老;Western Blot检测TPP1表达缺失后细胞中磷酸化的p53水平和p21蛋白的表达,探讨ATM-p53信号转导通路在抑制TPP1表达引起端粒DNA损伤反应过程中的作用机理。 6. TPP1表达缺失对丧失ATM活性和p53功能细胞(ATM-/-细胞)的染色体稳定性的影响:将shTPP1质粒转染缺失ATM活性和丧失p53功能的MEF细胞ATM-/-,通过染色体荧光原位杂交(PNA-FISH)法分析细胞染色体的畸变与染色体分裂后期桥(anaphase bridge)的形成。 7.染色体不稳定性导致细胞具有致瘤性转化能力和在体内形成肿瘤:软琼脂糖法(soft agar assay)检测抑制TPP1表达后的ATM-/-细胞(ATM-/--shTPP1)具有致瘤性转化的能力;通过采用重症免疫缺陷(SCID)小鼠皮下接种缺失TPP1表达的ATM-/--shTPP1细胞,观察抑制TPP1表达在小鼠体内对肿瘤形成的影响。收获形成的肿瘤组织细胞,通过PNA-FISH方法分析肿瘤细胞的染色体的异常状况。 实验结果: 1.成功构建了逆转录病毒介导的靶向TPP1的shRNA表达载体shTPP1;Western Blot结果表明shTPP1能明显抑制外源性TPP1蛋白的表达;RT-PCR显示,shTPP1能有效地降低细胞内源性TPP1在转录水平的表达。 2. IF/PNA-FISH方法证实,抑制TPP1表达后外源性Pot1a和Pot1b不能定位在端粒上,TdT-FITC实验结果显示,缺失TPP1表达后大约50%的细胞出现TdT-FITC阳性,并且阳性信号与端粒叠加在一起。 3. ATM+/+细胞中抑制TPP1表达后,端粒损伤标志物γ-H2AX和53BP1在染色体端粒形成TIF,但是在ATM-/-细胞中却没有TIF的形成。Western Blot分析发现,ATM+/+细胞中抑制TPP1表达后,γ-H2AX磷酸化水平明显增高,而在ATM-/-细胞中则为阴性。 4.在原代培养的p53+/+细胞中抑制TPP1表达后导致细胞增殖受限,生长缓慢。出现细胞衰老的特征性标志β-gal染色阳性反应,并且导致p53磷酸化,p21蛋白表达上调。 5.在ATM-/-MEF细胞中抑制TPP1表达后,诱导染色体发生明显的畸变,形成分裂后期桥,出现不同类型的异常染色体,包括染色体的不同融合,如p-p融合,q-q融合,p-q融合等,以及出现双分染色体。 6. Soft agar实验结果表明,ATM-/--shTPP1细胞可以在软琼脂糖上生长,并形成细胞转化克隆。而对照组细胞ATM-/--vector和ATM+/+-shTPP1都不能形成细胞转化克隆。 7.具有致瘤性转化能力的ATM-/--shTPP1细胞在SCID小鼠皮下形成肿瘤,肿瘤细胞中呈现各种类型的异常染色体,与转化细胞中形成的异常染色体类型一致。 结论: 1.体外成功构建了逆转录病毒介导的shTPP1表达载体,转染MEF细胞后能够有效地抑制TPP1的表达。 2. TPP1是Pot1a或Pot1b定位于端粒所必需的,缺失TPP1表达后引起端粒末端降解而失去保护,导致端粒功能异常。 3.抑制TPP1诱发端粒发生ATM依赖的DNA损伤反应,诱导p53依赖的细胞衰老。 4.在失去ATM与p53的细胞中抑制TPP1表达,诱导DDR导致细胞染色体畸变,形成分裂后期桥,标志着缺失TPP1表达诱导的端粒功能异常导致了染色体异常与基因组不稳定。 5. ATM-/--shTPP1细胞染色体功能异常,导致细胞具有致瘤性转化能力,并能在SCID小鼠体内形成肿瘤。 生物学意义: 1. shTPP1是一种在细胞内研究TPP1基因失去功能的有用工具。 2.抑制TPP1表达诱导的端粒功能异常,导致端粒发生ATM依赖的DNA损伤反应,启动p53介导的细胞衰老机制。 3.失去TPP1将导致端粒功能异常,与丧失ATM-p53信号转导通路共同作用,促进端粒功能异常导致的染色体不稳定,细胞致瘤性转化和肿瘤形成。 4. TPP1在维持端粒保护蛋白复合体Shelterin的结构和阻止端粒被不正当识别为双链DNA断裂而诱发DNA损伤反应,启动DNA修复等过程中起着及其重要的作用。 5.端粒功能异常诱导的ATM-DDR-p53-细胞衰老机制为肿瘤的治疗提供了一种新途径。