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《重庆医科大学》 2010年
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利用pSOS-HUS系统筛选靶向乙肝病毒X基因的siRNA的研究

韦德芳  
【摘要】: 目的:构建靶向HBx的真核表达载体pSOS-x-siRNA和pSOS-siRNA,分别同时转染肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15,筛选和验证高效HBxsiRNA。 方法:设计并合成4个特定xsiRNA, xsiRNA和HBx基因插入载体pSOS-HUS,得到重组体pSOS-x-siRNA;pSOS-x-siRNA经酶切去除目的片段HBx后得到pSOS-siRNA。脂质体转染法将质粒组pSOS-x-siRNA和pSOS-siRNA分别同时转人HepG2和HepG2.2.15肝癌细胞株。在荧光显微镜下观察HepG2细胞中GFP减弱程度预估干扰效率。用ELISA方法检测HepG2.2.15细胞上清HBsAg、HBeAg蛋白表达,Western Blot方法检测HepG2.2.15细胞胞内蛋白HBsAg、HBcAg的表达,Real Time PCR方法检测HepG2.2.15细胞内HBsmRNA、HBxmRNA的转录水平,进行验证。 结果:转染4天时,siRNA4使HepG2细胞的GFP信号表达程度最低,为阴性对照的10%,预测其干扰效果最强;siRNA4使HepG2.2.15细胞转染后4天上清的HBsAg蛋白表达为对照的13.92±1.94%(p0.05)、HBeAg为21.69±4.92%(p0.05),胞内的HBsAg、HBcAg蛋白表达量灰度比值为0.110±0.018、0.085±0.028均为各处理组中最低(p0.05),HBx mRNA和HBs mRNA分别下降为对照的0.110±0.022, 0.237±0.028(p0.05),差异有统计学意义,证实siRNA4为高效干扰位点。 结论: pSOS-HUS载体在肝癌细胞系HepG2、HepG2.2.15中,可直接利用绿色荧光较阴性对照减弱程度筛选高效的HBxsiRNA ,利用pSOS-HUS质粒成功构建靶向HBx的siRNA筛选验证体系。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R735.7

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