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《泸州医学院》 2011年
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系统性硬皮病患者外周血内皮祖细胞数量和功能的研究

姚丽萍  
【摘要】:目的:硬皮病是以局限性或弥漫性皮肤及内脏器官结缔组织的纤维化或硬化,最后发生萎缩为特点的疾病。按累及的范围的不同分为局限性硬皮病和系统性硬皮病(systemic scleroderma, SSc)。它的病因和发病机制目前尚不清楚,病因可能与遗传、性别和环境因素有关,发病机制多认为与血管病变、自身免疫学说、胶原过程异常等有关。其中微血管系统病变被认为是硬皮病发病的始动因素之一。内皮祖细胞(endothelial progenitors cells, EPCs)也被称为成血管细胞,是血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)的前体细胞,当机体血管损伤时,它能聚集到该区域促进血管新生。国外已有研究发现系统性硬皮病患者均存在不同程度的血管生成障碍,其外周血内皮祖细胞的数量低于正常人。本文的研究目的旨在通过比较健康人与系统性硬皮病患者外周血内皮祖细胞数量和增殖、迁移、黏附功能,来探讨血管内皮祖细胞与系统性硬皮病发病的关系,为明确硬皮病的病因病机提供新的线索,为寻找硬皮病的治疗新方法提供理论依据,从而减轻激素及免疫抑制剂带给系统性硬皮病患者的不良反应,对延缓系统性硬皮病患者的病情进展,改善患者的生活质量起到一定作用。方法:随机选取我院皮肤科门诊和住院部诊断明确的20例系统性硬皮病患者作为实验组,本院门诊体检的20例健康人作为对照组。在无菌条件下采集各组受试者外周血(peripheral blood, PB)10ml,用肝素抗凝,在室温下的水平离心机内,采用密度梯度离心法分离出单个核细胞(Mononuclear cells, MNCs)并且计数。然后将上述分离的单个核细胞接种于培养瓶中培养,当细胞贴壁以后就诱导其分化生长,同时每天将细胞放在倒置相差显微镜高倍镜下观察,并用相机拍照记录下细胞的生长情况。采用DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)和FITC标记的荆豆凝集素I(FITC-UEA-I)染色,荧光显微镜观察显示桔黄色荧光的细胞。流式细胞仪检测FITC-CD133+、PE-CD34+或FITC-CD133+、PerCP/Cy5.5-VEGFR2+双荧光标记鉴定的内皮祖细胞。采用MTT比色法,在自动酶标仪上选490nm波长测各孔的吸光度值(0ptical density, OD),分别以培养72小时后检测的吸光度值为实验值,培养24小时检测的吸光度值为对照值,按照以下公式计算:增殖率=[(OD实验值)/(OD对照值)-1]×100%,以观察内皮祖细胞的增殖能力。采用millicell小室和黏附能力测定实验,分别观察内皮祖细胞的迁移和黏附能力。最后采用统计学软件SPSS13.0进行数据处理,实验数据以均数±方差(x±s)表示,组间均数比较采用t检验。结果:体积较小的圆形细胞为新鲜分离的单个核细胞,悬浮在培养液中。单个核细胞在48小时后体积开始增大并且贴附在培养瓶瓶壁上。当细胞培养了4—5天后便有了明显地增殖,部分细胞于是就形成周围为放射状排列的长梭形细胞,的中心为圆形细胞细胞集落。经过7天的培养有的长梭形细胞呈网格样生长,有的线形生长,排列成鹅卵石样。荧光显微镜下观察到DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-I双荧光标记的细胞显示桔黄色荧光,即为内皮祖细胞。流式细胞仪检 测发现实验组同时表达FITC-CD133~+、PE-CD34~+或FITC-CD133~+、PerCP/Cy5.5-VEGFR2~+的细胞所占比例为0.10%±0.09%,与对照组0.49%±0.09%相比,P值小于0.01,差异有统计学意义,系统性硬皮病患者外周血内皮祖细胞数量较健康者减少。实验组外周血EPCs增殖率为13.01±4.33%,对照组为23.28±4.34%;两组相比,P值小于0.01,有统计学意义,实验组外周血EPCs增殖能力较对照组低下。实验组迁移到millicell小室底层的EPCs为(7.20±3.67)个/视野,对照组为( 14.15±2.98)个/视野;两组相比,P值小于0.01,有统计学意义,实验组外周血EPCs迁移能力较对照组低下。实验组贴壁的EPCs为(15.20±4.40)个/视野,对照组为(24.80±3.58)个/视野;两组比较,P值0.01,有统计学意义,实验组EPCs黏附能力较对照组有所下降。结论:系统性硬皮病患者外周血内皮祖细胞数量减少,增殖、迁移和黏附功能降低。患者和健康者比较,患者外周血中内皮祖细胞的数量较少,P值0.01,有统计学差异;患者外周血内皮祖细胞的增殖能力下降,黏附能力低下,迁移能力减退,三者的P值均0.01,差异有统计学意义。这一结果一方面证实了在系统性硬皮病中出现血管内皮损伤的病理表现,另一方面也提示我们可以通过增加外周血内皮祖细胞的数量和优化该细胞的功能来促进损伤血管的愈合,从而达到治疗系统性硬皮病的目的。
【学位授予单位】:泸州医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R593.25

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