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《四川医科大学》 2015年
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抗胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)全人源单链抗体的筛选及特性分析

朱建光  
【摘要】:目的:抗体针对相应抗原具有高度的特异性和亲和性,使抗体在疾病的诊断和治疗中显示出了其他类型药物无可比拟的优势。抗体药物经历了多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体三个阶段。多克隆抗体来自于B细胞产生的抗体混合物,亲和力相对较高但特异性不好;单克隆抗体来自于单个B细胞,特异性强纯度高但多为鼠源性抗体,对于人体存在排斥反应;基因工程抗体又称重组抗体,是利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行改造和重组而制备的抗体,目前基因工程抗体主要包括有嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体等。近年,抗体药物向低抗原性、高特异性方向发展,利用体外筛选技术筛选全人源抗体成为抗体药物主要发展趋势。人胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)是一种新型的、与白细胞介素-7(IL-7)类似的细胞因子,当过敏性炎症发生时其在皮肤角质形成细胞和气道上皮细胞高度表达,能强烈刺激髓系树突状细胞(Den-driticcell, DC)介导的Th2型炎症反应发生。在全基因组相关研究中,发现TSLP基因是一种与易患过敏性疾病相关的位点之一。在小鼠、灵长类动物实验模型中,已证实TSLP是诱导Th2型过敏性炎症疾病的关键启动因子。鉴于TSLP在过敏性疾病中发生的重要作用,本研究通过噬菌体展示技术从天然噬菌体抗体文库中筛选抗TSLP全人源单链抗体,并对筛选的单链抗体进行特性分析,为过敏性炎症疾病提供新的治疗途径。方法:扩增TSLP cDNA,将目的基因与表达载体pET104/D-TOPO连接,转化大肠杆菌BL21, IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化鉴定。以生物素化TSLP蛋白为抗原利用噬菌体展示技术对前期构建的天然抗体文库进行3轮富集,用ELISA检测技术从富集的单链抗体文库中筛选抗TSLP全人源单链抗体(scFv)。用BstN I酶切方法对筛选抗TLSP-scFv阳性克隆子进行指纹图谱分析;将指纹图谱不同的克隆子连接LZ16载体,转化大肠杆菌BL21后进行表达纯化,用Dot blot及Western blot方法对表达纯化的抗TLSP-scFv蛋白进行鉴定;用间接非竞争ELISA分析纯化后抗TLSP-scFv抗体效价;用竞争ELISA方法检测scFv和TSLP受体与TSLP的竞争结合,分析scFv与TLSP受体是否作用于TSLP的同一抗原表位,从而达到封阻TSLP与受体结合的功能;用大分子相互作用分析技术对抗TSLP全人单链抗体进行特异性及亲和力分析。结果:①TSLP抗原的表达纯化及鉴定:对TSLP基因的开放阅读框(ORF)进行了PCR扩增,扩增的TSLP cDNA片段大小为423 bp左右;将cDNA与pET101/D-TOPO连接,转化BL21进行表达,表达的TSLP蛋白大小为26 KDa左右;Dot blot及Western blot鉴定显示表达的蛋白正确,为TSLP目的蛋白。②.抗TSLP全人源单链抗体筛选与表达:以生物素化TSLP蛋白为抗原,采用噬菌体展示技术对全人源抗体文库进行3轮富集,通过ELISA检测有35%的scFv与TSLP有结合特性;将与TSLP结合能力强的单链抗体基因与原核分泌性表达载体LZ16相连接,构建重组表达载体scFv-LZ16,对单链抗体进行表达及纯化,结果显示scFv在大肠杆菌DH5aF'中主要为分泌性表达,表达产物主要集中在细胞周质间,为可溶性表达,抗体具备生物学活性。③.抗TSLP全人源单链抗体特性分析:SDS-PAGE电泳显示纯化后的单链抗体大小为27 KDa左右,Dot blot、 Western blot及测序结果显示表达纯化的单链抗体蛋白正确;非竞争ELISA实验结果显示表达的单链抗体可与抗原良好结合,对单链抗体进行倍比稀释,随着单链抗体蛋白浓度降低,与抗原结合能力随之降低,单链抗体最低可以稀释至100倍;大分子相互作用实验(Blitz)结果显示抗TSLP全人源单链抗体特异性好,与其他相关细胞因子没有交叉反应,与相应抗原TSLP反应较好且得到亲和力KD值为10-7,可见筛选得到抗TSLP全人源单链抗体有较高特异性和亲和力;竞争ELISA结果显示:TLSPR和筛选的单链抗体可竞争性的与TSLP结合,说明TSLPR和单链抗体作用于TSLP的相同抗原表位,可有效封阻TSLP-TSLPR信号通道具有生物学功能。结论:成功筛选到有较高特异性和亲和性并有生物学功能的抗TSLP全人源单链抗。
【学位授予单位】:四川医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R392

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