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《西南医科大学》 2020年
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冬凌草甲素通过抑制巨噬细胞Mincle减轻急性肾损伤小鼠肾脏炎症的研究

严颖  
【摘要】:目的:短期缺血再灌注后可导致急性肾损伤(AKI),即缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injure,IRI),它是临床上最常见的并发症之一,目前尚缺乏特效的治疗药物。冬凌草甲素是从冬凌草中提取出来的传统中草药,研究表明其具有显著的抗肿瘤、抗炎症和抗纤维化作用,具有潜在的开发应用价值,但在缺血再灌注手术后构建的急性肾损伤模型中的作用研究甚少。本实验拟通过小鼠体内和细胞体外研究初步探讨冬凌草甲素对AKI小鼠的治疗作用及其可能存在的作用机制,以期为临床上围绕急性肾损伤的药物开发提供研究思路。方法:1.体内实验观察冬凌草甲素对AKI小鼠肾脏的作用:取8~10周龄的SPF级C57BL/6J小鼠(雄性)18只,体重约为20~25 g,随机分成假手术组(control组)、IRI模型组(IRI组)、冬凌草甲素治疗组(OR组,15 mg/kg),每组6只,适应性喂养一周后采用结扎双侧肾动脉35 min的方法制作IRI动物模型,其中治疗组给予冬凌草甲素,control组和IRI组给予同等体积的DMSO溶剂,连续灌胃3天后处死小鼠,检测肾脏功能指标血肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)的变化;HE染色观察肾脏结构和炎性细胞浸润情况;PAS染色观察肾间质基质沉积严重程度;免疫组织化学和Western blot法检测炎症指标(iNOS、MCP-1、IL-1β和TNF-α)和AKT/NF-κB通路蛋白的表达情况。2.体外实验探讨冬凌草甲素对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应作用及其机制:将小鼠巨噬细胞细胞(Raw264.7巨噬细胞系)置于5%CO_2、37℃和足够湿度的细胞培养箱中,给予10%FBS的DMEM高糖培养基培养,当细胞生长到80%融合度时,用0.25 g/L胰蛋白酶消化,传代备用;将细胞分成正常对照组(control组)、模型组(LPS组,200ng/mL)、溶剂对照组(LPS+DMSO组)、冬凌草甲素治疗组(LPS+5μM OR组);处理24 h后倒置显微镜下观察细胞形态变化;Real-time PCR、ELISA以及免疫荧光法观察分泌的炎症因子变化;Western Blot法检测Mincle和AKT/NF-κB通路相关蛋白表达水平;并通过细胞回复实验进一步明确冬凌草甲素是依赖巨噬细胞的Mincle而发挥其抗炎症作用,即在给予冬凌草甲素干预处理时,转染Mincle表达质粒,采用Real-time PCR和ELISA法检测炎症因子分泌,Western Blot法观察AKT的变化情况。结果:1、体内实验:1)冬凌草甲素对小鼠肾功能的影响:治疗组小鼠SCr与BUN相比于IRI模型组,出现明显下降,且差异具有统计学意义,表明冬凌草甲素可以有效改善小鼠急性肾功能的损伤;2)肾脏病理结果:HE和PAS染色结果显示,IRI模型组中出现严重的肾小管扩张,部分肾小管上皮细胞的脱落,并有明显的基质蛋白的沉积,而经过冬凌草甲素治疗后,肾小管扩张程度明显减轻,基质蛋白沉积区域减少,表明该药物可以减轻病理改变;3)对炎症因子分泌的影响:Real-time PCR、ELISA及其免疫组化结果显示,冬凌草甲素可以减轻IL-1β、TNF-α、MCP-1等促炎症细胞因子在基因与蛋白水平的表达;4)对Mincle表达的影响:免疫荧光结果显示,巨噬细胞表面标记物F4/80和表达于巨噬细胞表面的C型凝集素受体Mincle在IRI模型组中均出现显著升高,治疗后明显下降;5)冬凌草甲素对AKT/NF-κB通路相关指标的影响:Western Blot结果显示,与假手术组相比,p-NF-κB和p-AKT在IRI模型组内表达显著升高,而经过冬凌草甲素治疗后活性下降,差异具有统计学意义(P0.05)。2、体外实验:1)对细胞形态的影响:与正常对照组相比,LPS刺激24 h后Raw264.7细胞出现胞体变大,胞内出现空泡,细胞形态变得十分不规则,溶剂对照组与模型组细胞形态无显著差异,经过冬凌草甲素干预治疗后,形态基本恢复正常;2)对促炎细胞因子的影响:Real-time PCR、Western Blot和免疫荧光法等多种实验结果均显示,模型组炎症指标相关蛋白表达明显升高,溶剂对照组与模型组间各指标表达无显著差异,加入冬凌草甲素进行干预治疗后可以有效的降低炎症相关蛋白的表达;3)对Mincle/AKT/NF-κB信号轴的影响:模型组中Mincle/AKT/NF-κB在蛋白水平均出现显著升高,冬凌草甲素干预后表达下降;4)细胞回复实验:转染Mincle质粒组相比于冬凌草甲素单独作用组,可观察到细胞分泌的炎症因子显著增多,p-AKT表达也明显升高,表明冬凌草甲素的抗炎症作用是依赖于Mincle。结论:1、冬凌草甲素可以显著改善缺血再灌注小鼠的急性肾损伤程度;2、冬凌草甲素可以降低LPS刺激Raw264.7产生的促炎细胞因子的表达;3、冬凌草甲素可能通过下调Mincle表达,影响AKT/NF-κB信号通路发挥抗炎症作用。
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