MG132对早期糖尿病肾病大鼠ERK1/2信号通路的作用研究

【摘要】： 目的：糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病严重的微血管并发症之一,其发病机制尚未完全阐明,治疗措施有限。目前认为氧化应激(ROS)、蛋白质糖基化终末产物(AGEs)、血管紧张素Ⅱ以及多种细胞因子等因素均可激活丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase pathway,MAPK)这一共同信号通路,从而导致糖尿病肾病的发生发展。细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2,即p44/42MAPK)是目前阐述最早、最主要的MAPK途径。丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MKP)是MAPK信号通路特异性负性调节因子,可通过对MAPK脱磷酸化调节从而使MAPK灭活。近年来研究发现MKP-1受泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome pathway,UPP)的泛素化降解调节,UPP可特异降解MKP-1,使其蛋白水平降低,对MAPK的灭活减少,MAPK信号通路激活。现已公认,糖尿病肾病时MAPK活性增加而MKP-1活性降低,但UPP是否通过降解MKP-1参与糖尿病肾病时MAPK信号通路的调节未见文献报道,蛋白酶体抑制剂是否能抑制糖尿病肾病MAPK信号通路的激活而具有治疗糖尿病肾病的‘作用也值得关注。故本研究以链脲佐菌素(STZ)诱导早期糖尿病肾病大鼠模型,以特异性蛋白酶体抑制剂MG132治疗糖尿病肾病大鼠,通过尿蛋白、肾脏光镜、电镜、ERK1/2和MKP-1蛋白表达及纤维连接蛋白(FN) mRNA表达的研究,探讨UPP在大鼠早期糖尿病肾病发病中的可能作用机制及蛋白酶体抑制剂对糖尿病肾病的治疗作用。方法：1、糖尿病大鼠模型的建立及分组：将50只健康雄性Wistar大鼠适应性喂养一周后,随机分为模型组(40只)和正常对照组(Normal control,NC组,10只)；模型组一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ,60mg/kg),对照组给予等体积的枸橼酸缓冲液。模型组成模后随机选取30只纳入实验并随机平均分成3组：①糖尿病+MG132高浓度治疗组(MH组)：MG132腹腔注射,0.1mg/kg.d、②糖尿病+MG132低浓度治疗组(ML组)：MG132腹腔注射,0.05mg/kg.d和③糖尿病组(Diabetes mellitus,DC组)。DC组和NC组每天给予等体积的0.9%生理盐水腹腔注射。2、于6周和8周时收集各组大鼠尿液检测24小时尿微量白蛋白、尿蛋白/尿肌酐浓度比值；心脏采血检测空腹血糖。3、肾脏组织病理检查：清洁取肾,石蜡包埋,行HE和Masson染色,观察肾小球和肾小管间质纤维化变化。4、透射电镜观察肾脏超微结构变化：观察肾小球和肾小管间质情况。5、蛋白免疫印迹(Western-blot)检测各组肾脏组织p-ERK1/2、t-ERK1/2及MKP-1蛋白表达。6、实时荧光定量RT-PCR检测各组肾脏组织纤维连接蛋白(FN)mRNA表达。7、统计学处理：应用SPSS13.0统计软件分析数据,数据均以均数±标准差(x±s)表示,各组间比较用单因素方差分析,两两比较采用q检验,组内比较采用独立样本均数t检验,检验水准α=0.05,P＜0.05表示有统计学意义。结果：1、大鼠一般情况指标：①血糖：各模型组较NC组血糖升高(P＜0.01)；MH组、ML组与DC组间血糖无明显差异(P＞0.05)；8周血糖与6周比较无明显差异(P＞0.05)。②体重：与NC组相比,各模型组体重明显减少(P＜0.01),其中以DC组最为显著；与DC组相比,MH、ML组体重增加(P＜0.05)；与ML组比较,MH组体重增加(P＜0.05)；各模型组8周体重较6周差异有统计学意义(P＜0.05)。③24小时尿微量白蛋白(UAER)、尿蛋白／尿肌酐浓度(Up/Ucr)比值：与NC组相比,各模型组UAER及Up/Ucr均增加(P＜0.05)；与DC组相比,MH组、ML组UAER及Up/Ucr降低(P＜0.05)；MH组UAER及Up/Ucr较ML组减少(P＜0.05)；8周和6周相比无统计学差异(P＞0.05)。2、HE染色：DC组、MH组、ML组肾小球体积增大,肾小管肿胀。Masson染色：NC组肾脏无明显改变；DC组MH组、ML组均可见肾小球系膜区异常物质沉积,MH组较DC组轻,ML组与DC组相近；各组8周与6周比较无明显差异。3、电镜：各模型组均可见部分基底膜增厚不规则,内皮细胞水肿,足突水肿或融合。以上改变在MH组、ML组较DC组轻,MH组较ML组轻；8周与6周相比无明显变化。4、肾组织p-ERK1/2、t-ERK1/2和MKP-1蛋白表达：①与NC组比较,各模型组总ERK1/2(t-ERK1/2)蛋白无明显变化,而磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表达增高(P＜0.05)；与DC组相比,MH、ML组p-ERK1/2蛋白表达减少(P0.05)；MH组较ML组减少(P＜0.05)；各模型组8周p-ERK1/2表达与6周比较差异有统计学意义(P＜0.05)。②与NC组比较,各模型组MKP-1蛋白表达均减少(P＜0.05)；与DC组比较,MH、ML组MKP-1蛋白表达升高(P＜0.05)；MH组较ML组增加(P＜0.05)；8周与6周相比差异有统计学意义(P＜0.05)。5、肾组织FN mRNA表达：与NC相比,各模型组FN mRNA增加,以DC组明显(P＜0.01)；MH组、ML组表达较DC组减少(P＜0.05)；MH组较ML组FN mRNA表达更少,差异有统计学意义(P＜0.05)；8周和6周相比差异无统计学意义(P＞0.05)。结论：1、糖尿病肾病时MKP-1的泛素化降解增加使MAPK信号通路活化,参与了糖尿病肾病的发生。2、蛋白酶体抑制剂MG132可抑制MKP-1的泛素化降解,使MKP-1表达上调,从而抑制MAPK通路,具有糖尿病肾病的治疗作用。

【关键词】：糖尿病肾病 泛素蛋白酶体途径 胞外信号调节激酶1/2 丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R587.1
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