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《泸州医学院》 2010年
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HOXA9在髓系白血病细胞HL-60中的表达

郭巍伟  
【摘要】: 目的:本课题主要探讨同源盒基因(Homeobox genes, HOX) HOXA9 mRNA及HOXA9蛋白在髓系白血病细胞HL-60中的表达情况,以及用全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid, ATRA)和/或三氧化二砷(Arsenic trioxide,As2O3)进行干预后对其表达的影响,在基因和蛋白水平研究HOX介导的白血病的发病机制。方法:1.采用HL-60细胞株作为白血病模型。2.实验分4组:(1)对照组(Normal):不加药物,代之等量RPMI 1640培养液加入基本培养体系。(2) ATRA组:加入ATRA稀释液。(3)As203组:加入As203稀释液。(4) ATRA+As2O3组:同时加入ATRA及As203稀释液。3.进行细胞增殖抑制实验,确定所加药物的最终浓度。4.采用肿瘤细胞体外培养技术,以ATRA和(或)As203持续干预HL-60细胞,观察对照组、ATRA组、As203组、ATRA+As2O3组的HL-60细胞,在培养过程第1天、2天和3天的生长情况。5.采用瑞氏姬姆萨染色法鉴定细胞及其生长分化情况。6.实时荧光定量PCR法观察HOXA9 mRNA的表达情况:6.1第1天、第2天、第3天分别提取各组细胞总RNA,用1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA分子的完整性。6.2通过随机引物将总RNA逆转录为cDNA,采用实时荧光定量逆转录多聚酶链反应(fluorogenic quantitive reverse transcription polymerize chain reaction, FQ-RT-PCR)技术检测细胞增殖分化过程中各组HOXA9基因的表达。6.3随机抽取逆转录的HOXA9基因进行电泳分别获得HOXA9基因在1天、2天、3天电泳图。将HOXA9基因cDNA和ACTB基因阳性产物cDNA梯度稀释制作各自的标准曲线,根据各个样本循环指数增长期的起始点即循环域值(cycle threshold,Ct)和标准曲线斜率计算各自样本起始cDNA模板量倍数值,以ACTB基因作为内参进行标化。6.4 PCR统计方法:结果用DNA相对拷贝数和RNA相对表达量(2-△△Ct)表示HOXA9基因相对表达量,采用均数加减标准差(Χ±S)表示HOXA9基因的变化情况。进行方差齐性检验,TOW-WAY AONVA方差分析,组间均数两两比较用LSD法,用统计学软件SPSS17.0完成。7.蛋白免疫印迹(Western blot)法观察HOXA9蛋白的表达情况:7.1第1天、第2天、第3天分别裂解细胞提取各组细胞总蛋白。7.2用Western blot分别检测各组细胞中的HOXA9蛋白的表达:用BCA试剂盒测定样品总蛋白浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、考马斯亮蓝染色观察蛋白条带、电转移(electrotransfer)、封闭PVDF膜、免疫反应(加入一抗和二抗)、化学发光显示目的条带。7.3图像分析:将Western blot结果传送至计算机,用QUANTITY ONE图像分析软件对蛋白条带进行分析,得到积分光密度值,用内参做校正得到积分光密度相对比值,代表蛋白相对表达量。7.4 Western blot统计方法:分析各组细胞中HOXA9蛋白表达的差异,所有数据用Χ±s表示,采用TOW-WAY AONVA方差分析,P0.05有统计学意义。由统计学软件SPSS17.0完成。结果:1.不同浓度ATRA、As2O3及ATRA+As2O3处理细胞后,各种药物10-5mol/l组细胞增殖受到明显抑制,细胞数量未增加,’很快细胞全部死亡;10-6mol/l和10-7mol/l各组细胞数量逐渐增多,细胞生长到达高峰后生长趋于平缓,两种浓度细胞生长趋势接近,结合国内外文献报道以及方便实验过程中加取药物,选取10-6mol/l为药物干预的最终浓度。2.细胞的形态学鉴定,瑞氏姬姆萨染色法证明所培养的细胞是粒细胞。Normal组细胞第1天和第3天相比形态无明显变化;各实验组第1天和第3天相比,第3天细胞变形,细胞核变为大小不一的不规则形,可见分叶核、肾形核、蚕豆核,细胞核相对缩小,核/质比变小,说明细胞向成熟方向分化。3.本实验各组的HOXA9基因表达都呈先上升后下降趋势,第1天就有表达,在第2天表达上升,而在3天表达降低。本实验各组的HOXA9蛋白第1天就有表达,对照组与ATRA组HOXA9蛋白表达呈先上升后下降趋势;As2O3组与ATRA+As2O3组HOXA9蛋白表达呈逐渐下降趋势。4.在HL-60细胞体外培养过程中,培养体系中加入终浓度为10-6mol/l ATRA、10-6mol/l As2O3、10-6mol/l ATRA+As2O3持续干预,ATRA组HOXA9基因的表达在各时间点较对照组高,差异有统计学意义;第1、3天As2O3组与ATRA+As2O3组HOXA9基因表达量较对照组HOXA9基因表达量差异无统计学意义;第2天As2O3组与ATRA+As2O3组HOXA9基因表达量较对照组HOXA9基因表达量高,差异有统计学意义。ATRA组HOXA9蛋白的表达量在各时间点较对照组高,差异有统计学意义;第1天As2O3组与ATRA+As2O3组HOXA9蛋白表达量较对照组HOXA9蛋白表达量高,差异有统计学意义;第2天As2O3组与ATRA+As2O3组HOXA9蛋白表达量较对照组HOXA9蛋白表达量低,差异有统计学意义;第3天As2O3组HOXA9蛋白表达量较对照组HOXA9蛋白表达量差异无统计学意义,ATRA+As2O3组HOXA9蛋白表达量较对照组HOXA9蛋白表达量低,差异有统计学意义。结论:1.10-6mol/L的ATRA、As2O3及ATRA+As2O3能促进HL-60向成熟细胞分化。2.HOXA9基因、HOXA9蛋白在人髓系白血病细胞HL-60中有表达。3.10-6mol/L的ATRA能上调人髓系白血病细胞HL-60中HOXA9基因、HOXA9蛋白的表达。10-6mol/L的As2O3,ATRA+As2O3能调节人髓系白血病细胞HL-60中HOXA9基因、HOXA9蛋白的表达,但无明显规律性。4.HOXA9基因可能是人髓系白血病细胞HL-60向成熟细胞分化过程的主要调控基因之一。5.ATRA、As2O3治疗白血病的机制可能与调节HOXA9基因、HOXA9蛋白的表达有关。
【学位授予单位】:泸州医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R733.7

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