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《泸州医学院》 2010年
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乙醛激活肝星状细胞中Wnt与TGF-β信号通路的Crosstalk研究

陶忠桦  
【摘要】: 目的:Wnt信号转导通路是近年来分子生物学、细胞生物学和肿瘤研究中的一大热点,参与了胚胎发育及成体组织细胞增殖、分化及凋亡等调控过程。Wnt信号通路的异常活化与肾、肺、肝、心脏以及皮肤等组织器官纤维化的发生与进展关系密切。本研究采用肝星状细胞株体外培养,MTT, VG染色,ELISA, Western Blotting等检测方法,探讨Wnt与TGF-β信号通路在乙醛刺激肝星状细胞活化中交叉对话(crosstalk)的可能机理,然后从肝星状细胞活化程度的角度观察两条通路crosstalk的功能效应。首先,乙醛刺激HSC细胞株,通过VG染色法从形态学角度观察HSC活化程度;MTT法检测活化的HSC的增殖程度;ELISA法测定HSC内胶原蛋白Ⅰ以及纤维粘连素FN含量,证明乙醛能有效刺激肝星状细胞株活化。接着采用SB-431542特异性阻断TGF-β信号通路,Western blotting检测Wnt信号通路下游产物β-catenin的磷酸化水平;TDZD-8特异性阻断GSK-3β,进一步激活Wnt途径,Western bloting检测TGF-β通路中Smad3的磷酸化状态;同时使用SB-431542和TDZD-8检测β-catenin以及Smad3的磷酸化,以分析两通路可能存在的crosstalk。方法:(1)HSC-T6细胞株分为未处理组(阴性对照组),乙醛激活组(阳性对照组),TDZD-8处理组(Wnt激活对照组),乙醛激活+TDZD-8处理组(Wnt激活组),乙醛激活+SB-431542处理组(TGF-β通路抑制组,而Wnt途径激活),乙醛激活+SB-431542+TDZD-8处理(Wnt途径进一步激活而TGF-β通路抑制)。各组细胞培养至融合度70%-80%时,0.4%胎牛血清DMEM培养基同步化处理细胞12h后,更换为10%胎牛血清DMEM完全培养基。对照组用对应的抑制剂处理培养,刺激组在对应的抑制剂预处理1h后给予乙醛刺激(终浓度200gmol/L)刺激,每12h补加一次,刺激24h。之后提取细胞总蛋白,G250法测定蛋白含量,SDS-PAGE电泳分离,Western Blotting检测各目的蛋白含量,检测指标包括:Wnt途径下游产物总β-catenin,磷酸化β-catenin, TGF-β途径总smad3,磷酸化的p-smad3-S425,磷酸化的p-smad3-S204。根据Western印迹膜上蛋白条带灰度,采用Quantity One分析软件进行处理,对不同受体拮抗剂或激活剂作用后各蛋白磷酸化水平的改变进行分析。(2)分组同(1),所有细胞均在6孔板中爬片,细胞处理方案同(1),待处理完毕,将细胞爬片做VG染色,显微镜下观察及照相。细胞培养上清液做ELISA检测纤维粘连素FN和胶原蛋白Ⅰ含量变化。(3)将96孔板接种HSC-T6细胞株,分组同(1),每组设3复孔,细胞处理方法同(1),光镜下观察细胞生长状况,MTT法检测细胞活性。结果:(1)乙醛激活HSC细胞株后,MTT法检测细胞增值活性明显上升,ELLSA检测出纤维粘连素FN和胶原蛋白Ⅰ以及平滑肌动蛋白α-SMA含量均有不同程度的增多,VG染色示胶原含量增多,说明酒精的代谢产物乙醛对肝星状细胞的活化有明显的刺激作用。(2)使用Wnt途径激活剂TDZD-8 (GSK-3β特异性阻断剂)激活Wnt途径后,Wnt途径下游产物β-catenin表达无明显变化,但p-β-catenin水平下降;在另一组使用SB431542阻断TGF-β通路,下游产物β-catenin无明显变化,p-β-catenin水平也下降;使用TDZD-8和SB431542同时阻断TGF-β通路,激活Wnt途径,β-catenin表达量无明显变化,p-β-catenin水平明显下降。(3)使用Wnt途径激活剂TDZD-8(GSK-3β特异性阻断剂)激活Wnt途径后,TGF-β途径的关键因子Smad3的S425和S204磷酸化水平并无明显变化;使用SB431542阻断TGF-β途径后S425和S204表达都明显降低;同时使用TDZD-8和SB431542,S425和S204水平降低但降幅不如单阻断TGF-β途径。结论:(1)乙醛激活HSC细胞后,可以使HSC细胞进一步活化,其分泌产物Ⅰ型胶原蛋白及纤维粘连素明显增多,细胞增殖并转分化。(2)在乙醛激活的肝星状细胞中,TGF-β信号通路的抑制可导致Wnt信号通路的激活,因此TGF-β信号通路对Wnt信号通路具有抑制效应。(3)乙醛可导致肝星状细胞TGF-β信号通路激活,且Wnt与TGF-β两条信号通路之间存在"crosstalk",Wnt信号通路对Smad3的S425和S204的磷酸化修饰具有拮抗效应。
【学位授予单位】:泸州医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R575.2

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