脾肾两虚证双生子脑瘫的生物学基础研究

【摘要】：目的 ①通过脑瘫双生子病证结合调查,分析脑瘫的高危因素,探讨中医脾虚、肾虚证候在脑瘫中的分布规律。 ②通过对脾肾两虚证脑瘫患儿的理化指标检测,分析细胞免疫、体液免疫、血清元素与脑瘫的关系,探讨中医脾肾两脏与机体免疫功能的关系。 ③基于基因表达谱技术筛选4对脾肾两虚证“脑瘫-正常”同卵双生子差异表达基因,从基因表达水平探讨脾肾两虚证脑瘫的分子机制。 方法 O宏观脑瘫的病证结合研究：利用脑瘫脾肾证候量表对43对脑瘫双生子进行病证结合调查研究,探讨脑瘫的病因及脾虚、肾虚证候分布特征。 ②理化指标检测：应用免疫浊度技术检测脑瘫组及正常组血清IgG、IgM、IgA、C3和C4含量,流式细胞术比较脑瘫组与正常组外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞百分比,原子吸收光谱法比较血清锌、铁、钙、镁及铜元素含量。 ③微观特征基因的芯片筛选：借助基因芯片技术,对筛选的4对脾肾两虚证“脑瘫-正常”双生子进行基因表达谱试验,利用GO、KEGG、FatiGO+等数据库筛选脾肾两虚证脑瘫特征基因表达谱。 ④芯片结果的RT-PCR验证：对基因芯片筛选到的部分差异表达基因进一步采用RT-PCR方法进行验证。 结果 ①43对脑瘫双生子病证结合调查：脾肾两虚证脑瘫患儿的危险因素依次是低出生体重、缺氧窒息、早产、出生后烦躁少食等；79.59%的患儿调查到的危险因素为两种或者两种以上；证候调查结果显示多数患者以脾气虚证和肾精不足证为主导；同卵双生子具有病和证罹患的一致性,但存在着病情轻重程度的差异；筛选到4对“脑瘫-正常”双生子用于基因芯片试验。 ②51例脑瘫患者理化检测结果：脾肾两虚证脑瘫组外周血CD3+T细胞、CD8+T细胞的百分比显著低于正常对照组(P0.01)；血清IgG含量显著低于对照组(P0.05),IgM含量显著高于对照组(P0.01),C3含量下降显著(P0.01)；血清锌、铁、钙和铜元素含量均显著低于对照组(P0.01),镁元素含量差异不显著(P0.05)。 ③4对“脑瘫-正常”双生子基因表达谱结果：从4对双生子中分别筛选到2703、20、130、350个差异表达基因,GO、PATHWAY分析结果提示免疫基因的差异表达及免疫通路的异常为四对双生子的共同特征,其中细胞因子-细胞因子受体为4对双生子筛选到的差异表达基因共同注释到的通路。 ④15个差异表达基因的RT-PCR验证结果：应用RT-PCR对筛选的部分差异表达基因进行验证,发现FIGN基因在脾肾两虚证脑瘫组患者中的表达显著低于正常组(P0.05),PTGER2基因在脑瘫组患者中表达显著高于正常组(P0.05),其它13个基因差异表达不稳定。 结论 ①脾气虚证和肾精不足证是脑瘫的基础证。 ②脑瘫的危险因素多样,绝大多数脑瘫患儿的高危因素在两种以上。 ③脾肾两虚证脑瘫患儿存在细胞免疫和体液免疫功能异常及血清元素锌、铜、钙、铁水平低下的状态。 ④脾肾两虚证脑瘫的发生涉及多个基因的异常表达,尤其是参与免疫的GO类别及免疫通路的相关基因,提示脑瘫脾肾两虚证的关键病机之一是免疫紊乱的遗传相关性。 ⑤应用RT-PCR对筛选的差异基因进行验证,初步论证了FIGN、PTGER2基因的异常表达与脾肾两虚证脑瘫的关系,为该病证的深入研究奠定了基础。

【关键词】：脾肾两虚 脑瘫 双生子 基因表达谱
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R277.7
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