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《成都中医药大学》 2010年
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补肾中药对卵细胞体外成熟的影响

段恒  
【摘要】：目的探讨含补肾中药鼠血清对小鼠卵细胞体外成熟的影响及其机制。 方法未成熟卵细胞来自孕马血清促性腺激素(PMSG)刺激后的90只ICR小鼠的卵巢。将收集的小鼠卵丘细胞-卵母细胞复合体(COCs)245个随机分为含补肾中药鼠血清1#、2#、3#组、空白鼠血清组、空白组,分别置入添加了2%含补肾中药鼠血清1#、2#、3#、2%空白鼠血清及未添加鼠血清的M199培养液中,采用微滴法培养24h,体视显微镜和倒置显微镜观察并计算小鼠卵细胞体外第一极体(PB1)排出率即成熟率。将COCs约238个随机分为含药鼠血清1#组、卵泡刺激素(FSH)组、空白鼠血清组、空白组,分别置入添加了2%含药鼠血清1#、100IU/L FSH、2%空白鼠血清及未添加鼠血清的M199培养液中,显微镜观察并计算小鼠卵细胞体外成熟率、受精率及卵裂率,实验重复3次。将COCs随机分为含药鼠血清1#组、卵泡刺激素(FSH)组、空白鼠血清组、空白组,免疫荧光标记法结合反射荧光显微镜观察细胞骨架指标(纺锤体、染色体),及成熟促进因子(MPF)调节亚基周期蛋白B(CyclinB)的表达；荧光检测仪定量分析Cyclin B1的表达强度。将COCs随机分为含药鼠血清1#组、空白鼠血清组,半定量RT-PCR检测卯母细胞MPF调节亚基Cyclin Bl mRNA的表达。采用酶联免疫法测定含药鼠血清1#、2#、3#与空白鼠血清FSH和雌二醇(E2)水平。 结果 1.含药鼠血清1#、2#组均较空白组卵细胞成熟率明显增高(42.31%、36.17% vs 16.67%,分别P0.01、P0.05);含药鼠血清1#组较空白鼠血清组卵细胞成熟率明显增高(42.31% vs 22.92%,P0.05)；含药鼠血清1#组较空白组生发泡破裂和第一极体(GVBD+PBl)出现率明显增高(84.62% vs 66.67%,P0.05)；含药鼠血清各组之间GVBD+PBl和成熟率比较,无显著性差异。 2.FSH组、含药鼠血清1#组均较空白组卵细胞成熟率明显增高(33.69%、40.98% vs 17.71%,P0.01)：FSH组、含药鼠血清1#组均较空白鼠血清组卵细胞成熟率明显增高(33.69%、40.98% vs 22.81%,分别P0.05、P0.01)；FSH组、含药鼠血清1#组均较空白组GVBD+PBl明显增高(80.75%、83.61% vs 64.00%,P0.01)：FSH组、含药鼠血清1#组均较空白鼠血清组GVBD+PBl明显增高(80.75%、83.61% vs 71.35%,分别P0.05、P0.01);FSH组与含药鼠血清1#组GVBD+PBl和成熟率比较,无显著性差异;各组之间受精率及卵裂率总体上无明显差异。 3次重复实验分次结果显示基本一致。FSH组、含药鼠血清1#组均较空白组卵细胞成熟率明显增高,分别P0.05、P0.05或P0.01；含药鼠血清1#组均较空白血清组卵细胞成熟率明显增高,P0.05;FSH组、含药鼠血清1#组均较空白组GVBD+PBl明显增高,分别P0.05、P0.05或P0.01；FSH与含药鼠血清1#组GVBD+PBl和成熟率比较,无显著性差异。 3.FSH、含药鼠血清1#组CyclinBl的荧光强度较空白组、空白鼠血清组明显增强(15069.00±3908.88、17936.50±4717.42 vs 5029.50±1656.61、6625.33±1777.41,P0.01);FSH与含药鼠血清1#组比较,无显著性差异。含药鼠血清1#组Cyclin Bl mRNA的表达(Cyclin Bl/GAPDH=2.78)较空白鼠血清组(Cyclin Bl/GAPDH=2)增强。空白组、空白鼠血清组、FSH组、含药鼠血清1#组卵子骨架各组之间比较,无显著性差异。含药鼠血清1#、2#、3#组血清FSH和E2水平均较空白鼠血清组高,无显著性差异。 结论含补肾中药鼠血.清1#体外可以促进小鼠未成熟卵细胞生长发育,主要是促进卵细胞核成熟,并且不增加成熟卵细胞细胞骨架的异常几率。其机制与增强卵细胞成熟促进因子调节亚基Cvclin Bl的表达有关。
【关键词】：补肾中药 卵母细胞体外成熟 细胞骨架 成熟促进因子 周期蛋白B1
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R285
【目录】：
  • 摘要3-4
  • Abstract4-8
  • 缩略词表8-9
  • 照片清单9-10
  • 引言10-11
  • 含补肾中药鼠血清对小鼠卵细胞体外成熟的影响11-35
  • 1 材料与方法11-20
  • 1.1 实验材料11-16
  • 1.1.1 实验动物11
  • 1.1.2 实验药物11-13
  • 1.1.3 主要试剂13-14
  • 1.1.4 主要仪器设备与耗材14-15
  • 1.1.5 溶液的配制与吸卵针的制作15-16
  • 1.2 实验方法16-20
  • 1.2.1 小鼠卵细胞的采集16
  • 1.2.2 实验分组及观测指标16-17
  • 1.2.3 卵细胞成熟率的测定17
  • 1.2.4 小鼠精子的采集及处理17
  • 1.2.5 免疫荧光标记法17-18
  • 1.2.6 荧光定量分析MPF调节蛋白Cyclin B1的表达强度18
  • 1.2.7 卵母细胞细胞骨架的观察方法18-19
  • 1.2.8 卵细胞总RNA的提取19
  • 1.2.9 RT-PCR检测卵母细胞MPF调节亚基Cyclin B1 mRNA的表达19-20
  • 1.2.10 血清FSH、E_2的测定20
  • 1.3 统计学处理20
  • 2 结果20-35
  • 2.1 不同含药鼠血清对卵细胞体外成熟的影响20-22
  • 2.2 含药鼠血清对卵细胞体外成熟的影响22-31
  • 2.2.1 含药鼠血清对卵细胞体外成熟的影响122-24
  • 2.2.2 含药鼠血清对卵细胞体外成熟的影响224-26
  • 2.2.3 含药鼠血清对卵细胞体外成熟的影响326-28
  • 2.2.4 含药鼠血清对卵细胞体外成熟的影响(A)28-30
  • 2.2.5 含药鼠血清对卵细胞体外成熟的影响(B)30-31
  • 2.3 含药鼠血清对体外培养卵细胞MPF调节蛋白Cyclin B1的表达强度的影响31-33
  • 2.4 含药鼠血清对体外成熟卵母细胞细胞骨架的影响33-34
  • 2.5 含药鼠血清对体外成熟卵母细胞MPF调节亚基Cyclin B1 mRNA表达的影响34
  • 2.6 不同补肾中药对大鼠血清FSH和E_2水平的影响34-35
  • 讨论35-49
  • 1 补肾中药对卵细胞体外成熟的影响研究有助于拓展ART的应用空间35-38
  • 2 含补肾中药鼠血清可以促进小鼠卵细胞体外成熟38-42
  • 2.1 卵母细胞是一种很特殊的细胞38
  • 2.2 含补肾中药鼠血清可以提高小鼠卵细胞体外成熟率38-41
  • 2.3 含补肾中药鼠血清可以增强体外小鼠卵母细胞Cyclin B1的表达41-42
  • 3 含药鼠血清不增加体外成熟卵母细胞细胞骨架的异常机率42-46
  • 3.1 观察卵子骨架对于评价卵母细胞的质量和受精发育潜能是可靠的42-44
  • 3.2 卵子骨架的观察中温度及固定等影响因素的控制是十分重要的44-45
  • 3.3 含补肾中药鼠血清不增加小鼠体外成熟卵细胞细胞骨架的异常几率45-46
  • 4 补肾法是促进卵细胞体外成熟的有效手段46-49
  • 4.1 补肾中药可以促进卵细胞生长发育46-47
  • 4.2 补肾法是卵细胞体外成熟安全有效的促进手段47-49
  • 结论49-50
  • 致谢50-51
  • 参考文献51-60
  • 附图60-62
  • 在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果62-64
  • 附录64-90
  • 综述64-90
  • 参考文献78-90

【参考文献】
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