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《成都中医药大学》 2011年
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肿节风对人前列腺癌DU-145细胞PI3K/Akt/mTOR信号传导通路的影响

周仕轶  
【摘要】：目的：探讨中药肿节风对人雄激素非依赖性前列腺癌DU-145细胞增殖的影响以及对DU-145细胞增殖抑制的机理。 方法：采用细胞培养技术,将肿节风胶囊配制成2.5mg/ml、1.25mg/ml和0.625mg/ml三个不同浓度组的溶液,分别处理DU-145细胞48小时。以光镜观察DU-145细胞形态变化,以MTT法检测DU-145细胞增殖情况,以ELLISA法和RT-PCR法检测PI3K、Akt、mTOR和P70S6K蛋白的浓度和表达情况。 结果：肿节风溶液作用DU-145细胞48小时后,出现了细胞凋亡的形态学改变,表现为数量减少、体积缩小、染色质凝集、核固缩；DU-145细胞增殖受到抑制,呈一定的量效关系；ELLISA法检测DU-145细胞PI3K、Akt、mTOR和P70S6K的吸光度OD值(代表上述物质浓度)均不同程度降低；RT-PCR法检测DU-145细胞PI3K、Akt、mTOR和P70S6K的表达均不同程度降低。两种检测法得出结果一致。 结论：肿节风可破坏DU-145细胞正常生长,抑制DU-145细胞增殖；其机制与其能降低促雄激素非依赖性前列腺癌发生与发展的PI3K/Akt/mTOR信号传导通路的关键因子PI3K、Akt、mTOR和P70S6K的浓度和表达有关。
【关键词】：肿节风 人前列腺癌DU-145细胞 细胞增殖PI3K/Akt/mTOR信号传导通路 MTT ELLISA RT-PCR
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R737.25
【目录】：
  • 摘要3-4
  • ABSTRACT4-6
  • 中英文缩略词表6-8
  • 目录8-12
  • 前言12-18
  • 1. 研究前列腺癌治疗的意义12-14
  • 1.1 前列腺癌的流行病学调查12-13
  • 1.1.1 前列腺癌的发病率调查12
  • 1.1.2 前列腺癌的死亡率调查12-13
  • 1.2 前列腺癌的治疗现状和问题13-14
  • 2. 中药治疗前列腺癌的国内外研究现状概况14-16
  • 3. 中药肿节风治疗肿瘤的研究现状概况16
  • 4. 本课题研究的思路和主要内容16-18
  • 实验研究一18-32
  • 1. 实验材料18-19
  • 1.1 实验药物18
  • 1.2 细胞来源18
  • 1.3 主要试剂18-19
  • 1.4 主要实验仪器19
  • 2. 实验方法19-24
  • 2.1 常用溶液配制19-20
  • 2.2 人前列腺癌DU-145细胞培养及保存20-21
  • 2.2.1 人前列腺癌DU-145细胞的培养及换液20
  • 2.2.2 人前列腺癌DU-145细胞的传代培养20-21
  • 2.2.3 人前列腺癌DU-145细胞的冻存21
  • 2.3 实验用药的配制和作用21-22
  • 2.3.1 肿节风溶液和LY294002溶液的溶解21
  • 2.3.2 药物作用于DU-145细胞21-22
  • 2.3.2.1 肿节风溶液对DU-145细胞的作用21-22
  • 2.3.2.2 LY294002溶液对DU-145细胞的作用22
  • 2.4 观测指标及实验方法22-24
  • 2.4.1 DU-145细胞形态学观察22-23
  • 2.4.1.1 标本制备(细胞爬片,加药)22-23
  • 2.4.1.2 形态学观察23
  • 2.4.2 MTT法检测肿节风溶液对DU-145细胞增殖的影响23-24
  • 2.4.2.1 MTT法实验原理23
  • 2.4.2.2 MTT法实验步骤23-24
  • 2.4.3 细胞增殖抑制率计算24
  • 2.5 统计学方法24
  • 3. 实验结果与分析24-28
  • 3.1 肿节风对DU-145细胞形态学的变化24-26
  • 3.2 肿节风对DU-145细胞增殖的影响26-27
  • 3.3 肿节风对DU-145细胞生长抑制率的影响27-28
  • 4. 研究小结28-32
  • 实验研究二32-43
  • 1. 实验材料32-33
  • 1.1 实验药物32
  • 1.2 细胞来源32
  • 1.3 主要试剂32-33
  • 1.4 主要实验设备和仪器33
  • 2. 实验方法33-35
  • 2.1 ELLSA法检测原理33
  • 2.2 实验步骤33-35
  • 2.2.1 细胞培养和药物作用33-34
  • 2.2.1.1 肿节风溶液对DU-145细胞的作用33-34
  • 2.2.1.2 LY294002溶液对DU-145细胞的作用34
  • 2.2.2 ELLISA法检测标准步骤34-35
  • 3. 实验结果与分析35-40
  • 3.1 肿节风溶液对PI3K浓度的影响35-36
  • 3.2 肿节风溶液对Akt浓度的影响36-37
  • 3.3 肿节风溶液对mTOR浓度的影响37-39
  • 3.4 肿节风溶液对P70~(S6K)浓度的影响39-40
  • 4. 研究小结40-43
  • 实验研究三43-62
  • 1. 实验材料43-44
  • 1.1 实验药物43
  • 1.2 细胞来源43
  • 1.3 主要试剂43-44
  • 1.4 主要实验设备和仪器44
  • 2 实验方法44-50
  • 2.1 不同浓度梯度的药物直接作用DU-145细胞44-45
  • 2.1.1 DU-145细胞培养44
  • 2.1.2 细胞计数44-45
  • 2.1.3 接种45
  • 2.1.4 分组45
  • 2.1.5 加药45
  • 2.2 细胞总RNA的提取45-46
  • 2.3 RT-PCR基因表达产物扩增46-50
  • 2.3.1 RNA质量检测及含量测定46-47
  • 2.3.2 将RNA反转录为cDNA47-48
  • 2.3.3 引物序列48-49
  • 2.3.4 PCR基因扩增49-50
  • 3. 实验结果与分析50-58
  • 3.1 RNA电泳结果50
  • 3.2 RT-PCR结果50-58
  • 3.2.1 ACTB(β-actin)50-51
  • 3.2.2 肿节风溶液对DU-145细胞PI3K表达量的影响51-52
  • 3.2.3 肿节风溶液对DU-145细胞Akt表达量的影响52-54
  • 3.2.4 肿节风溶液对DU-145细胞mTOR表达量的影响54-56
  • 3.2.5 肿节风溶液对DU-145细胞P70~(S6K)表达量的影响56-58
  • 4. 研究小结58-62
  • 讨论62-105
  • 1. 中医对前列腺癌的认识62-67
  • 1.1 对前列腺癌病位的认识62
  • 1.2 对前列腺癌病名的认识62-63
  • 1.3 对前列腺癌病因的认识63
  • 1.4 对前列腺癌病机的认识63-67
  • 2. 选择中药肿节风的依据67-80
  • 2.1 肿节风的中药鉴定学研究67-68
  • 2.2 肿节风的中药化学研究68-70
  • 2.2.1 萜类及挥发油68-69
  • 2.2.2 黄酮(苷)类69
  • 2.2.3 有机酸类69
  • 2.2.4 香豆素类69-70
  • 2.2.5 酚酸类化合物70
  • 2.2.6 其他70
  • 2.3 肿节风的中药药理学研究70-75
  • 2.3.1 抗肿瘤作用70-72
  • 2.3.2 抗病毒、抗菌和抗炎镇痛作用72-73
  • 2.3.3 对白细胞和血小板的影响73
  • 2.3.4 增强机体免疫73-74
  • 2.3.5 其他74-75
  • 2.4 肿节风的临床应用研究75-80
  • 2.4.1 抗肿瘤临床应用75-76
  • 2.4.2 抗感染临床应用76-78
  • 2.4.3 其他应用78
  • 2.4.4 肿节风的临床不良反应分析78-80
  • 3. 现代医学对前列腺癌的认识80-95
  • 3.1 现代医学对前列腺癌致病危险因素和有益因素的认识80-86
  • 3.1.1 年龄和遗传因素80-81
  • 3.1.2 种族因素81-82
  • 3.1.3 饮食营养因素82-83
  • 3.1.4 维生素与微量元素83-84
  • 3.1.5 其他危险因素84-86
  • 3.1.5.1 性激素和性活动84-85
  • 3.1.5.2 植物雌激素85
  • 3.1.5.3 茶多酚85
  • 3.1.5.4 输精管结扎术85-86
  • 3.2 现代医学对前列腺癌治疗和治疗机理的认识86-95
  • 3.2.1 雄激素非依赖性前列腺癌的发生机制86-91
  • 3.2.1.1 低水平雄激素高敏感性通路86-87
  • 3.2.1.2 泛宿主受体87-88
  • 3.2.1.3 非雄激素通路88
  • 3.2.1.4 共活化物和共阻遏物88-89
  • 3.2.1.5 旁路通路89
  • 3.2.1.6 前列腺癌干细胞89-91
  • 3.2.2 雄激素非依赖性前列腺癌的治疗91-95
  • 3.2.2.1 二线内分泌治疗91-92
  • 3.2.2.2 化学治疗92-93
  • 3.2.2.3 分子靶向治疗93
  • 3.2.2.4 基因治疗93-94
  • 3.2.2.5 骨转移的治疗94
  • 3.2.2.6 中草药及有效成分治疗94-95
  • 4. 选择DU-145细胞的依据95-96
  • 5. 阳性对照药物LY294002的选择依据96
  • 6. 肿节风对人前列腺癌DU-145细胞的体外作用96-97
  • 6.1 对DU-145细胞形态的影响96-97
  • 6.2 对DU-145细胞增殖的影响97
  • 7. 肿节风抑制人前列腺癌DU-145细胞增殖机理的探讨97-105
  • 7.1 PI3K/Akt/mTOR信号传导通路的结构特征与活化98-99
  • 7.1.1 PI3K及其活化98
  • 7.1.2 Akt及其活化98-99
  • 7.2 PI3K/Akt/mTOR信号传导通路在激素依赖性前列腺癌转化为激素非依赖性前列腺癌中的作用机制99-103
  • 7.2.1 促进蛋白质合成和肿瘤血管形成99-100
  • 7.2.2 促进前列腺癌细胞周期进展和抗细胞凋亡100-102
  • 7.2.2.1 促进前列腺癌细胞周期进展100
  • 7.2.2.2 抗前列腺癌细胞凋亡100-102
  • 7.2.3 促进前列腺癌细胞运动和转移102
  • 7.2.4 与雄激素受体AR的作用102-103
  • 7.3 肿节风对PI3K/Akt/mTOR信号传导通路的影响103-105
  • 结论105-106
  • 问题与展望106-107
  • 致谢107-108
  • 参考文献108-118
  • 文献综述118-128
  • 参考文献126-128
  • 在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果128-129

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