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《成都中医药大学》 2012年
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基于~1H-NMR代谢物组学技术的多基源中藏药品种质量评价研究

范刚  
【摘要】:中药/民族药的质量控制关系到药物临床使用的安全性和有效性。由于药材本身成分的复杂性,加上仪器分析条件、研究思路和方法的局限,中药/民族药的质量控制一直缺乏行之有效的方法。目前,中药/民族药质量控制及评价的研究角度、思路和方法需要总结和创新,以期建立一套既能反映整体观和系统性,又能体现“安全有效、科学、先进实用”等特点的中药/民族药质控方法。 中药/民族药品种的多基源性自古有之,品种的多样性与复杂性导致来源混杂、真伪难辨、优劣难评,严重制约药材的质量控制、质量标准制订、临床合理利用和新药开发。利用现代科学技术加强复杂多基源中药/民族药的品种鉴别、质量控制与评价研究,促进药材质量标准的完善与提高,是提升中药/民族药的科技水平,推动其现代化、产业化的必由之路。 目的:以常用多基源中药“黄连”及藏药“藏茵陈”为模式药物,采用代谢物组学技术研究不同品种药材的代谢物差异,寻找特征代谢标志物(metabolic markers),为黄连和藏茵陈药材的品种鉴别、质量控制及临床合理利用提供理论依据,也为当前中药/民族药的质量控制及评价提供方法学参考。 方法: 1、采用1H-NMR代谢物组学技术,建立黄连药材的整体代谢物指纹图谱,并结合主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)等方法,系统分析三个黄连品种(味连Coptis chinensis、雅连C. deltoidea和云连C. teeta)的初生和次生代谢产物差异,并找出引起差异的代谢标志物。 2、应用定量核磁共振(qNMR)技术,建立黄连药材中小檗碱、黄连碱、非洲防己碱、药根碱等6种主要生物碱成分的定量分析方法,并采用配对t检验评价qNMR与常规HPLC定量方法的一致性。 3、采用1H-NMR代谢物组学技术,同时检测分析“藏茵陈”药材的整体代谢成分,结合PLS-DA、HCA方法研究5种獐芽菜属植物(印度獐牙菜Swertia chirayita、川西獐牙菜S. mussotii、抱茎獐牙菜S. franchetiana、四数獐牙菜S.tetraptera阳高獐牙菜S. elata)的代谢物差异及其亲缘关系。 结果: 1、从黄连提取物中同时检测出16个(类)化合物,包括小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱、非洲防己碱、药根碱、木兰花碱、绿原酸、阿魏酸、蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖、丙氨酸、不饱和脂肪酸类、饱和脂肪酸类、甾醇类。 根据PCA、PLS-DA结果,40个黄连药材样品分类为三组,每一组对应于一个品种。结合方差分析,发现了黄连碱、非洲防己碱、表小檗碱、巴马汀和脂肪酸类成分的含量在味连中最高,而云连和雅连分别含有最多的绿原酸和蔗糖。 2、成功建立了黄连药材中6种生物碱成分的qNMR定量分析方法,重复性、选择性良好,6种生物碱的平均回收率为96.93-102.39%。t检验结果显示本文建立的qNMR方法与常规的HPLC分析方法的定量结果基本一致(P0.05)。 3、从“藏茵陈”原植物药材中同时检测出25个属于不同化学类型的代谢成分,包括(1)口山酮类成分:芒果苷、1,8-二羟基-3,5-二甲氧基口山酮、1,8-二羟基-3,7-二甲氧基口山酮、1-羟基-3,7,8-三甲氧基口山酮、1,5,8-三羟基-3-甲氧基口山酮和7-0-[a-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-p-D-吡哺木糖]-1,8-二羟基-3-甲氧基口山酮;(2)环烯醚萜苷类成分:獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、落干酸、龙胆苦苷;(3)五环三萜类成分:齐墩果酸;(4)黄酮类成分:异荭草苷;(5)氨基酸类成分:丙氨酸、缬氨酸;糖类成分:蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖;(6)其他类成分:胆碱、没食子酸、甲酸、醋酸、丁二酸、饱和脂肪酸类、不饱和脂肪酸类、甾醇类。 根据PLS-DA和HCA的结果,五种獐牙菜属植物被明显分为五组,齐墩果酸、芒果苷、脂肪酸类和缬氨酸的含量在印度獐牙菜药材中最高,而四数獐牙菜含有最多的龙胆苦苷和胆碱,川西獐牙菜含有最多的落干酸和β-葡萄糖,抱茎獐牙菜含有最多的獐牙菜苦苷。 结论: 1、味连、雅连和云连代谢成分有明显的差异,临床使用时要注意生物等效性。黄连碱、表小檗碱、非洲防己碱、小檗碱、巴马汀、药根碱、蔗糖、脂肪酸类和绿原酸为黄连种间差异代谢物,其中表小檗碱和蔗糖在三个品种两两之间均有明显的差异,因此为黄连品种鉴别最重要的代谢标志物。 2、qNMR方法简便、快速、准确、重复性好,可以应用于黄连药材及其他含生物碱类成分药材的质量控制与评价。 3、五种獐牙菜属植物的代谢成分具有明显的差异,不应共同作为“藏茵陈’药材的原植物来源。齐墩果酸、芒果苷、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、落干酸、脂肪酸类、缬氨酸、胆碱、糖类为五种獐牙菜属植物种间差异的代谢标志物,今后可作为品种鉴别、质量控制的有效指标。从化学分类学角度来说,印度獐牙菜与其他四种獐牙菜的化学亲缘关系最远,而四数獐牙菜与川西獐牙菜的亲缘关系更近,抱茎獐牙菜和高獐牙菜的亲缘关系更近。 创新点: 1、本论文融合多学科理论和技术,创新性应用1H-NMR代谢物组学技术及分析方法,从整体代谢物组(metabolome)角度探索了复杂多基源中藏药品种鉴定、质量评价和化学分类学研究的新思路和新方法。 2、本文建立了黄连药材的整体代谢物指纹图谱,结合化学计量学方法,首次从代谢物组水平上研究了黄连三个品种(味连、雅连和云连)的初生和次生代谢产物差异,并发现了种间差异的代谢标志物。 3、首次建立黄连药材中小檗碱、黄连碱、药根碱、巴马汀、非洲防己碱、表小檗碱的qNMR定量分析方法,为其质量控制与评价提供了新的手段。 4、首次检测分析了“藏茵陈”药材中的整体代谢物组,包括口山酮及其苷类、五环三萜类、环稀醚萜苷类、黄酮类、糖类、氨基酸类及有机酸类等25个成分。其中,蔗糖、胆碱、甲酸、醋酸和丁二酸为首次报道。
【学位授予单位】:成都中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R291.4

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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【二级引证文献】
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【二级参考文献】
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