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《成都中医药大学》 2016年
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陈皮真菌与药效物质基础变化的相关性研究

王福  
【摘要】:陈皮为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟果皮,始载于《食疗本草》,具有理气健脾,燥湿化痰之功。为常用大宗中药材。中医理论认为陈皮“陈久者良”,其贮藏年限从一年、两年、三年至十余年不等,道地药材“新会陈皮”贮藏长达数十年,且贮藏越久价格越高。陈皮药材采收后一般贮藏1-2年使用,为久贮药材的代表,但陈皮在贮藏过程中,如养护不当,易发生霉变,从而导致有效成分发生变化,药材品质劣变,造成较大经济损失,药材霉变后产生的真菌毒素对中药的临床用药安全也造成一定影响。2015年版《中国药典》一部陈皮项下规定了黄曲霉毒素的含量,以确保临床用药安全。据报道,真菌通过代谢转化也可以对药材有效成分进行转化,并降低中药材污染真菌毒素的含量,因此真菌的代谢同时也有助于增加中药材的临床安全与疗效。综上,真菌的代谢对中药材的影响具有两面性。既往对陈皮“陈化”机制的研究报道中,未见对其真菌与陈皮药效物质基础变化的相关性探讨,本文首次对陈皮药材真菌对其内在化学品质的关系进行深入研究,以期为陈皮的科学贮藏养护及其陈皮“陈久者良”的原因解释提供参考。具体研究内容如下:1陈皮真菌的分离鉴定对8批陈皮真菌进行了分离鉴定,共分离得到25株菌株,分属于青霉属与曲霉属二类,共5种,分别为普通青霉、朱黄青霉、桔青霉、黄曲霉和黑曲霉,其中优势菌为黑曲霉。不同批陈皮样品真菌数为2-4株,桔青霉与普通青霉为所有样品共有真菌,各批样品真菌类型相似度较高。此外,有6批样品含有黑曲霉,2批样品含有黄曲霉,1批样品含有朱黄青霉。研究表明:陈皮真菌类群较为固定,主要为青霉属与曲霉属二类,桔青霉与普通青霉为共有真菌,黑曲霉、朱黄青霉、黄曲霉为差异真菌,优势菌为黑曲霉。2陈皮真菌的分子生物学鉴定青霉属真菌部分种类的显微结构相似度较大,为了更准确鉴定青霉属真菌,本实验对各批次样品中分离出的25株真菌进行DNA提取,采用通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增及测序实验。所有真菌菌株DNA提取、PCR扩增并测序成功,将测序结果进行Blast检索,结果表明,25株真菌均属于青霉属或曲霉属。同时构建邻(Neighbor-joining, NJ)系统发育树可以很好的区别各株真菌,普通青霉、桔青霉、黑曲霉、朱黄青霉与黄曲霉与相应NCBI下载序列聚为一支。结果表明:基于ITS序列所构建的NJ树可以准确鉴定从陈皮表面分离的各株真菌。该研究表明对于亲缘关系比较近,外观性状比较接近不同真菌类型的鉴别,基于通用引物的ITS序列分子鉴定方法具有一定的参考价值。3陈皮真菌的DNA提取方法比较及其产毒黄曲霉菌株的鉴定黄曲霉真菌的分子鉴定往往经过DNA提取、PCR扩增、电泳检测、测序及数据分析等步骤,整个过程往往要耗费2天左右的时间。现有文献也有黄曲霉真菌的分子鉴定报道,如黄曲霉特异性引物PCR鉴别、多重PCR鉴别等。但基本都存在DNA提取操作复杂、耗时、成本高等共性问题,为了建立黄曲霉真菌的快速鉴定方法,对黄曲霉的DNA提取方法进行研究,采用CTAB法、SD法、DNA提取试剂盒法与改良碱裂解法四种方法对陈皮表面浸染黄曲霉纯化菌株进行DNA提取,并采用特异性PCR对分离鉴定出的黄曲霉菌株进行产毒阴阳性鉴别。实验结果首次发现:改良碱裂解法与其它三种方法相比,具有操作简单、用时短及成本低廉的优势,仅仅需要10min就可以成功提取黄曲霉真菌的DNA,大大缩短了黄曲霉DNA的提取时间,并满足常规PCR反应,具有操作简单、用时短、成本低等优点。该研究结果为黄曲霉真菌的快速分子鉴定提供了参考。4陈皮恒温恒湿加速培养前后药效物质基础变化研究陈皮久储则良,但久储陈皮样品制备耗时较长,且容易发生霉变与虫蛀。为进一步了解陈皮真菌与药效物质的相关性,本文对陈皮样品进行恒温恒湿加速培养,从而加快陈皮真菌对药材药效物质基础的影响作用,同时采用紫外分光光度法及其高效液相色谱法对陈皮加速培养前后样品中总黄酮及其橙皮苷、芸香柚皮苷、川橙皮素、桔皮素等成分进行含量测定;采用GC-MS法对陈皮加速培养前后样品中挥发油成分变化进行研究。4.1陈皮加速培养前后黄酮类物质的变化陈皮加速培养后,芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、桔皮素呈不同程度增加趋势,其中陈皮苷、川陈皮素含量增加最为明显,霉变前后存在显著性差异,同时陈皮霉变后4种黄酮总量及其总黄酮含量显著增加。4.2陈皮加速培养前后挥发油类物质的变化陈皮加速培养后,从3批次、6个样品中共鉴定出46种化合物,鉴定出化合物含量占挥发油总含量的98.05%~99.99%。陈皮加速培养前样品之间化学成分相似度较高,且含量最高的二个化合物均为柠檬烯与萜品烯,表明3批次来源不同的陈皮样品中的挥发油具有相似的物质基础;而陈皮霉变后的样品在原有化学成分基本不变的基础上(仅少数化合物有例外,如Octahydro-1,3-methanopentalene、(R)-(+)-β-香茅醇),又分别增加了新的化合物,如:(+)-α-柏木萜烯、(+)-a-Elemene、 Eudesm-7(11)-en-4-ol、2,2-Dimethylchroman、5-十一炔、8,11-Octadecadienoic acid、棕榈酸甲酯等,因此由实验结果可知:陈皮经恒温恒湿加速培养后,挥发油总含量减少,但挥发油成分总数增加。研究结果首次揭示:陈皮真菌的代谢活动导致了陈皮中有效成分黄酮类成分含量的增加与挥发油成分类别的增加,这对解释陈皮“陈久者良”提供了化学成分方面的依据。5陈皮真菌与黄酮类成分的相关性探究本文首次将陈皮真菌返接回到无菌陈皮样品中,进而筛选导致陈皮黄酮类物质变化的真菌菌株。实验结果表明:黑曲霉、黄曲霉、朱黄青霉、普通青霉4种真菌均可以不同程度的引起样品中黄酮类成分的变化,其中黑曲霉可以明显提高陈皮样品中4种黄酮及其总黄酮含量。而其他菌株对样品中4种黄酮及其总黄酮含量影响均小于黑曲霉。结果表明:黑曲霉等真菌的代谢引起陈皮中黄酮类物质的增加可能是陈皮“陈久者良”的原因之一。
【学位授予单位】:成都中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q93;R284

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