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蕨麻抗肝炎药效物质及其肝靶向纳米粒冻干粉针剂的药学研究

袁海龙  
【摘要】: 慢性肝病特别是乙型肝炎是我国乃至世界范围的常见病、多发病之一,积极寻找防治病毒性乙型肝炎的有效药物及给药系统,是当今亟待解决的重点课题之一。我们在首都二四八重大创新基金支持下,研究发现蕨麻抗病毒性肝炎的有效部位(JMS)体内外均显示良好的抗病毒活性,但由于其局部血药浓度低,且药物很难进入肝实质细胞内杀灭病毒,故采用传统制药技术及给药方案并不能彻底地治疗乙肝。纳米技术在医药工业中的应用是高科技的重点发展领域之一。由于纳米粒具有良好的肝脏靶向性,有望成为抗乙肝病毒的优良载体。故本研究尝试开发一种中药的纳米级递送系统,这种纳米粒能够将所携带的药物靶向递送到靶细胞并释放药物,提高其抗肝炎治疗指数。 本文在药效学实验的基础上,筛选和确认了蕨麻抗病毒性肝炎的有效部位(JMS),并对其所含的化学成分进行了分离鉴定,其中主要成分命名为蕨麻苷,经中国科学技术信息研究所通过国际联机检索,确认该化合物为首次发现并鉴定的新化合物。 本文采用正交实验法优选乙醇提取工艺,确定乙醇提取部分生产工艺为用5倍量的70%乙醇提取3次,每次1小时;采用D101大孔吸附树脂进行除杂精制,蕨麻苷的比上柱量为2.28mg/g,比吸附量为2.27mg/g,水洗脱,以Molish反应阴性判定终点;30%乙醇洗脱,将洗脱液浓缩后以TLC检测蕨麻苷出现为终点,水及30%洗脱液另存他用。然后70%乙醇洗脱,蕨麻苷的比洗脱量为1.98mg/g,收集洗脱液,TLC检测蕨麻苷不再出现为终点,回收乙醇,70℃真空干燥,得有效部位。本文采用比色法测定总皂苷含量,结果表明含总皂苷已达80%以上;HPLC法测定蕨麻苷含量,方法稳定可靠;采用毛细管气相色谱法,配以顶空进样,对D-101型大孔树脂可 袁海龙 成都中医药大学博士学位论文 能带来的7种残留物即正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、 二乙烯苯进行测定,从检测结果可见,该有效部位中检测不到7种有机溶 剂,说明正常使用该树脂是安全的。 本文用乳化聚合法研制了获麻有效部位聚氛基丙烯酸正丁醋纳米粒 (JMS一PB以一NP),正交实验法优化了制备工艺。正交实验结果表明,PH值 具有非常显著的影响。确定最佳工艺条件是:溶液的pH值为2,主药浓度 2.5呢/毗,PBCA浓度4.0呢/毗,Dextran一70浓度为0.1%。按照最佳工艺 制备样品,包封率为81.97%,载药量为51.23%,粒子平均圆整,平均粒径 1 00一200二之间,说明最佳工艺稳定,重现性好。 在优化的纳米粒制备工艺条件下,研究了川S一PB以一NP的理化性质. 用透射电镜观察了粒子形态和大小,用纳米粒度分析仪测定了强度平均径, 体积平均径,数目平均径,多分散度和Zeta电位等指标,结果分别为 106.snm,228.5二,227.onm,190.gnm,0.29,一20.smv。粒径分布测定 图和多分散度数值表明,纳米粒的粒径并非完全均一,但绝大多数粒子粒 径集中在100一200nm之间,用HPLc法测定了未包封的药物含量,按相应 公式计算了载药量和包封率,结果分别为51.23%,81.97%.包封率大于80 %,说明几乎全部成粒子,证明本制备工艺具有可行性. 为了提高纳米粒体系的稳定性和靶向性,本文将JMS一PBCA一NP研制成 冻干粉针剂。结果表明:经冷冻干燥后,粒子形态、粒径、载药t和包封 率均无明显变化,且分散性良好,体外释药曲线呈明显的缓释特征,且制 剂稳定. 本文对伽S一PB以一NP的小鼠体内递送进行了初步研究.实验结果表明, 静注脚S一PB以一NP后1 smin,肝脏分布量可达8既左右,显著优于同剂t的 脚S。另外,在小鼠体内分布的经时初步研究表明,川S一PB以一NP在小鼠肝 脏中的川S的浓度高,且驻留时间更长。药代动力学实验结果表明,药物在 肝脏分布很快,tll:.(h)只有0.19h,但消除很慢,t:12,(h)为198h,呈明显 袁海龙 成都中医药大学博士学位论文 的缓释效应。利用体外大鼠肝细胞评价了纳米粒的细胞通透性,研究表明 纳米粒可使肝细胞对药物的摄取量明显增加,有的高达10倍以上,且摄取 时间对摄取量有明显影响。本试验观察了JMS一PBCA一NP冻干粉针在乙型肝 炎病毒转染的人肝癌细胞2.2.15细胞系培养中对细胞的HBsAg和HBeAg分 泌以及对HBV一DNA的抑制作用。结果表明JMS一PBCA一NP冻千粉针对HBeAg、 HBsAg和HBv一DNA的表达有较强的抑制作用,且明显优于脚S注射剂。鸭乙 型肝炎病毒感染鸭在感染后第7天用J’MS一PBCA一NP治疗,观察发现按 0.019/Kg,1次/天给药5天、10天和停药后3天J’’MS一PBCA一NP对感染鸭血 清DHBV一DNA水平的抑制效果有非常显著性作用(PO;01),结果表明 孙S一PBCA一NP使鸭乙型肝炎病毒感染鸭病毒学指标得到改善,具有良好的临 床应用前景。 为了考察其它高分子材料制备纳米粒的情况,同时增加纳米粒的主动 靶向性效果,我们对J’MS白蛋白纳米粒进行了初步研究。利用肝实质细胞 膜上有去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)这一特点,用含有末端半乳糖的糖蛋 白包裹药物,实现肝实质细胞的主动靶向给药。即利用白蛋白中赖氨酸残 基的侧链氨基与乳糖半缩醛基形成仲胺,从而使乳糖


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