骨髓间充质干细胞与脂肪干细胞对椎间盘退行性变修复作用的比较实验研究

【摘要】：目的： 通过比较骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）和脂肪干细胞(Adipose Derived Stem Cells, ADSCs）体外增殖与分化能力及对兔椎间盘退行性变修复效果，为将来椎间盘退行性变疾病临床干细胞治疗提供实验依据。 方法： 1.手术获取2周龄日本大耳白兔髓核组织并对其体外分离、培养。通过组织化学染色、免疫组织化学和免疫荧光染色对髓核细胞（NucleusPulposus Cells, NPCs）进行鉴定。 2.手术获取2周龄日本大耳白兔骨髓及皮下脂肪，经体外分离培养获得BMSCs及ADSCs。观察两种干细胞的生长曲线并计算各自的首次倍增时间，比较两种干细胞的体外增殖能力。 3.使用TGF-β1在体外分别将BMSCs和ADSCs诱导为类软骨细胞。采用组织化学染色、Ⅱ型胶原（CollagenⅡ，ColⅡ）蛋白和基因表达水平检测比较两者在体外的诱导分化能力。 4.采用髓核穿刺抽吸法建立兔椎间盘退行性变模型（抽吸髓核组织5~8mg）。 5.细胞移植动物分组：5月龄日本大耳白兔45只随机分为5组：（1）正常对照组（n=9）；（2）NPCs移植对照组（n=9）；（3）BMSCs移植组（n=9）；（4）ADSCs移植组（n=9）；（5）DMEM培养基对照组（n=9）。每只实验动物的L3-4、L4-5和L5-6作为实验干预椎间盘。 6.影像学评价：术后4、8、12周分别利用侧位X线检测并计算出各个椎间盘%DHI值（高度指数），MRI检测椎间盘T2加权像信号强度并计算出%ST2WI值（T2加权像标准化指数）评价修复效果。 7.组织化学评估：术后4、8、12周椎间盘经HE染色、番红O染色，并按照组织学评价标准计算出退变分数（degeneration score）评价修复效果。 8.特征性蛋白表达检测：采用免疫组化染色、免疫荧光染色以及实时定量PCR检测collagenⅡ和蛋白聚糖（aggrecan）的表达，评估术后4、8、12周两种特征性蛋白在髓核组织内的表达水平。 9.细胞外基质含量检测：采用二甲基亚甲蓝显色法、Hoechst33258荧光染色法分别检测术后4、8、12周各组硫酸化的糖胺聚糖（sGAG）、DNA的含量，计算出sGAG/DNA比值评估髓核细胞外基质含量。 结果: 1.兔髓核组织在体外可以进行分离培养，保持髓核细胞表型，分泌细胞外基质，collagenⅡ和aggrecan的表达基本维持正常。但髓核细胞分裂增殖能力较差，细胞首次倍增时间约96h。 2.从BMSCs与ADSCs的体外扩增培养的生长曲线得出ADSCs首次倍增时间约36h，BMSCs约为46h，表明在体外ADSCs分裂增殖速率较BMSCs快。 3.向类软骨细胞诱导分化结果显示BMSCs来源的细胞细胞外基质分泌和collagenⅡ表达水平较ADSCs来源的细胞高，表明BMSCs在体外诱导分化能力较ADSCs强。 4. X线与MRI结果显示：术后12周，DMEM组%DHI值与%ST2WI值均明显低于其它各组（P0.05），NPCs组和BMSCs组%DHI值与%ST2WI值均明显高于ADSCs组（P0.05），BMSCs组与NPCs组组间无明显差异。 5. HE和番红O染色显示：术后12周，正常对照组椎间盘退变分数明显低于其它组（P0.05）；NPCs组、BMSCs组和ADSCs组退变分数明显低于DMEM组（P0.05），但NPCs组、BMSCs组和ADSCs组组间无明显差异。 6. CollagenⅡ免疫组化和aggrecan免疫荧光染色显示：正常对照组、NPCs组、BMSCs组和ADSCs组均显示明显强阳性。而DMEM组表现为随着时间的推移阳性逐渐减弱。Real-time PCR结果显示：术后12周，DMEM组collagenⅡ和aggrecan mRNA的表达量明显低于其它组（P0.05），NPCs组和BMSCs组collagenⅡ和aggrecan mRNA的表达明显高于ADSCs组（P0.05），但NPCs组和BMSCs组组间无明显差异。表明BMSCs移植组collagenⅡ和aggrecan表达水平比ADSCs移植组高。 7. sGAG含量检测结果显示：术后12周， DMEM组髓核组织中sGAG/DNA值明显低于其它组（P0.05），NPCs组、BMSCs组sGAG/DNA值明显高于ADSCs组（P0.05），但NPCs组和BMSCs组sGAG/DNA值组间无明显差异。 结论： 1.在体外培养中ADSCs分裂增殖的速率快于BMSCs，可以在短时间获得大量的种子细胞；但BMSCs诱导分化能力比ADSCs强。 2.体内细胞移植实验结果表明BMSCs和ADSCs均能有效修复椎间盘髓核退变，但BMSCs的修复效果比ADSCs更好。

【关键词】：髓核细胞 骨髓间充质干细胞 脂肪干细胞 椎间盘退行性变 细胞移植
【学位授予单位】：川北医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R681.53
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