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沼泽红假单胞菌CQU01 AHL合成酶基因的鉴定、表达及对PHB积累的影响

陈宇  
【摘要】:群体感应(quorum-sensing,简称Qs)系统是指细菌通过一种自体诱导物(autoinducer, AI)的信号分子的产生、分泌和响应,感知周围细菌密度的变化,从而调控基因的表达。G一细菌的群体感应信号分子多为酰基高丝氨酸内酯衍生物AHL; G+细菌的群体感应信号分子通常是寡肽类;另外还有一类信号分子被认为是细菌种间“通用”的信号分子,即呋喃酰硼酸二脂AI-2。 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudanonas palustris)是光合细菌的一种,属于革兰氏阴性细菌。在光合细菌之一的类球红细菌中发现存在群体感应系统,而且群体感应系统还调控菌体内聚-p-羟丁酸(poly-β-hydroxybutyric acid,简称PHB)的积累和光合产氢。沼泽红假单胞菌也积累PHB和光合产氢,有文献报道在沼泽红假单胞菌内发现AHL类信号分子的存在,但是群体感应系统是否对PHB积累有调控作用还未可知。 比色法和报告菌株Agrobacterium tumefaciens JZAl [KYC55 (pJZ372) (pJZ384)(pJZ410)]对沼泽红假单胞菌CQU01产生自体诱导物AHL的能力做了检测,比色法结果显示沼泽红假单胞菌CQU01的AHL提取液通过颜色反应,变成咖啡色,说明沼泽红假单胞菌CQU01产生自体诱导物AHL;但是其上清液不能使报告菌株JZAl显蓝色,说明产生的信号分子超出了JZAl的检测范围,其酰胺链上的碳原子数可能大于14或者含有双键。 根据NCBI公布的5株沼泽红假单胞菌的基因序列,通过同源性比对,设计了一对特异性引物。以沼泽红假单胞菌CQU01的基因组DNA为模板,PCR扩增出650bp左右的DNA片段,测序比对发现此片段为自诱导物AHL合成酶基因RpaI。将扩增的DNA片段连接到pET-28a(+),转化至大肠杆菌DH5a中;蓝白斑筛选,诱导表达,检测到DH5α菌液中有AHL产生。说明以沼泽红假单胞菌CQU01为模板扩增到得DNA片段为AHL合成酶基因,并且将该基因在大肠杆菌DH5α中克隆表达,得到AHL信号分子。 利用乙酸乙酯萃取AHL,在接种沼泽红假单胞菌CQU01和沼泽红假单胞菌phbC缺陷菌株的培养基中添加不同浓度的AHL萃取液,通过测定沼泽红假单胞菌CQU01和沼泽红假单胞菌phbC缺陷菌株的PHB含量,发现厌氧生长时沼泽红假单胞菌CQU01的PHB积累减少;而沼泽红假单胞菌phbC缺陷菌株的PHB积累几乎没有变化。说明AHL可以抑制PHB积累;并且抑制作用很可能发生于PHB合酶途径。


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