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《西南大学》 2011年
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竹节参离体培养与鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因的克隆及代谢研究

张来  
【摘要】:竹节参(Panax japonicus C.A. Meyer)为五加科人参属多年生草本植物,是我国珍稀濒危的名贵“七类”中草药之一,被誉为“草药之王”,具有南药三七活血化瘀和北药人参滋补强壮之功效,有抗炎镇痛、免疫调节、抗心肌缺血、降血糖、抗衰老、抗疲劳、抗癌和改善学习记忆功能等多种生物活性。近年来,由于竹节参具有多种药理作用而广泛运用于临床,导致其需求量增大,野生资源遭到严重破坏,因此,仅仅依靠野生原料药的供应,在数量和质量上都很难以满足国内医药市场的需要。同时,外商也纷纷要求从中国订购竹节参三萜皂苷以开发口服液、胶囊、复方含片等产品,从而导致其价格一路走高。 为解决竹节参产业化发展的技术瓶颈,我们开展了以种子萌发为基础的组织培养和植株再生体系研究,以满足药农对竹节参种苗的需求。同时开展了竹节参的毛状根培养研究,以寻求一种既不破坏野生竹节参植物资源又能获取三萜皂苷的生产方式,以满足医药市场对竹节参三萜皂苷的需求。为了搞清竹节参中三萜皂苷生物合成途径,我们克隆了该途径上关键酶(Squalene Synthase, SS)基因,通过转基因技术在烟草中验证了其功能,为将来对竹节参高产三萜皂苷进行遗传改良奠定了理论基础。最后我们建立了竹节参根中总皂苷和5中人参皂苷单体的测试方法,并就其动态变化规律进行了分析,为竹节参毛状根培养和SS基因在烟草中的功能验证等实验中有关竹节参皂苷的检查提供了基本方法。本论文主要研究结果如下: 1.通过单因素试验和正交试验以筛选竹节参种子萌发的优化组合参数 单因素试验结果指出,竹节参种子萌发的最适GA3浓度、浸种温度、浸种时间为150 mg·L-1、25℃、24h;与此相对应的萌发率依次为95%,90%,90%。正交试验指出,竹节参种子萌发率的优化组合为A2B2C2,即GA3浓度为150 mg·L-1,浸种时间为24h,浸种温度为25℃;萌发指数的优化组合为A2B2C3,即GA3浓度为150 mg·L-1,浸种时间为24 h,浸种温度为30℃。 2.竹节参组织培养及其再生体系的建立 以MS培养基为基本培养基,竹节参外植体(茎)在0.05 mg·L-1NAA+2mg·L-1ZT时,不定芽再生率为96.3%;0.05 mg·L-1NAA+1.5 mg·L-1ZT的激素配比能显著提高不定芽的增值,增值系数为9.16;在1/2MS+2 mg·L-1NAA的生根培养基上进行生根培养,生根率为86.4%。 3.竹节参毛状根培养体系的建立及其次生代谢产物分析 发根农杆菌C58C1能诱导竹节参产生毛状根,浸染25min,诱导率最高(90%);共培养4d,诱导率最大(86.9%)。在竹节参毛状根培养过程中发现,高浓度的NAA和IAA对竹节参毛状根生物量的积累有抑制作用;而IBA只有在1mg·L-1时才有促进作用。竹节参毛状根培养到6周时生物量的积累达到较为理想状态,此后随着时间推移,积累效果不明显。 HPLC和紫外风光光度法检测表明,竹节参毛状根人参皂苷的合成可划分为启动期、指数增长期、稳定平衡期3个阶段。启动期一般在1-2周;指数生长期一般在2-6周(7周或8周);在稳定平衡期,人参皂苷含量增加幅度较小、甚至极小。在所有的竹节参毛状根单克隆系中,总皂苷含量动态变化规律是PJ9PJ8PJ7PJ6PJ2PJ4PJ1PJ5PJ3。除PJ3和PJ5毛状根单克隆系外,与人参皂苷Rg1、Rg2、Rh1和Rh2相比,Re在其它7个单克隆系中,合成能力最强、合成速度最快,含量最高,为竹节参毛状根培养的代表性物质。在含量层面,同五年生竹节参根相比较,培养九周的竹节参毛状根,其最大含量的总皂苷(PJ9)、Re(PJ8)、Rg1(PJ7)、Rg2(PJ3)、Rhl(PJ9)、Rh2(PJ6)分别提高13倍、7.5倍、13.8倍、28.9倍、29.9倍、43.8倍。 GC-MS分析指出,竹节参根和毛状根精油含量分别为0.45%和0.38%。在竹节参根精油中共检出40种化合物,竹节参毛状根中则检出45种,其中18种化合物为两者所共有,相对含量之和分别是59.30%和59.84%。竹节参根精油中的代表性物质为正己酸(11.6%),镰叶芹醇(10.04%)和3-甲基丁酸(9.56%);竹节参毛状根中的代表性物质为则正己酸(13.92%)、匙叶桉油烯醇(9.96%),1aR-(1aα,4α,4ap,7bα)-1a,2,3,4,4a,5,6,7b-八氢-1,1,4,7-四甲基-1H-环丙烯并奥(9.15%)。 4.竹节参鲨烯合酶(Squalene Synthase,SS)基因的克隆及其在烟草中的功能验证 利用RACE技术成功克隆了竹节参三萜皂苷合成途径上的关键酶(鲨烯合酶)基因SS,其大小片段为1353 bp,包括45 bp的5'-UTR,60 bp的3'-UTR和1248bp的ORF。整个ORF编码415个氨基酸,分子质量为109559.7 kD,分子式为C4054H6790N132001706S257,为疏水性蛋白质。生物信息学分析指出SS基因定位于叶绿体(cTP)、线粒体(mTP)和分泌途径(SP);SS氨基酸有两个跨膜结构域和八个motif结构位点;SS二级结构由a-螺旋、无规卷曲、延伸链、β-转角组成,其百分比依次为67.47%、22.41%、7.23%和2.89%。 成功构建SS基因的正、反义植物表达载体pCXSN-PjSS和pCXSN-antiPjSS,运用农杆菌LBA4404转化烟草。PCR检测表明,目的基因PjSS和antiPjSS以及潮霉素抗性基因Hyg均整合到烟草植株中;RT-PCR扩增指出,PjSS已经在烟草中转录为mRNA,并得到超量表达,而antiPjSS则抑制其表达。对人参皂苷Re含量测定表明,SS正义转基因烟草能提高人参皂苷Re的含量,SS反义转基因烟草则相反。 5.竹节参根皂苷的提取工艺及其含量检测方法的建立 正交试验结果指出,竹节参根总皂苷的提取工艺为A2B2C1,即材液比为1:10,甲醇浓度为65%,提取温度为50℃。用紫外分光光度法检测竹节参根中的总皂苷,以香草醛-高氯酸-冰醋酸-甲醇为显色体系,在波长560 nm时,建立回归方程为y=0.4024x+0.0043,R2=0.9999,线性范围为0.5μL·mL-1-2.5μL·mL-1。重现性、稳定性、精密度和加样回收率均小于5%,在所控范围之内,说明实验重现性和稳定性好,精密度和加样回收率高,可用于竹节参总皂苷含量的测定。用HPLC进行检测竹节参根中的5种人参皂苷单体Re、Rg1、Rg2、Rh1和Rh2,在波长203 nm下,建立线性回归方程依次为,y=42.08x+24.25、y=52.23x+43.87、y=40.09x+3.51、y=1 15.36x+32.41、y=98.46x+30.52,其线性范围和相关系数分别在0.18μg-15.45μg和0.996~0.998之间。重现性、稳定性、精密度和加样回收率试验指出,其相对标准偏差(RSD)均小于5%,在所控范围之内,符合样品测试要求。 含量动态变化分析指出,随着生长年限的增加,竹节参总皂苷含量逐步增加,其中一年生到四年生含量变化幅度较大,变幅超过50%,四年生到五年生相对较小,仅为9%,五年生竹节参根中总皂苷达到最大值,为87.2 mg·g-1。在每一年的不同时期,其含量变化规律是枯萎期果期花期营养生长期。因此,以根为药材,一般选择四年生的竹节参,在枯萎期采收较为合适。同理,5种人参皂苷含量随着生长年限的增加而增加,在五年生竹节参根中均达到最大值,其中ReRg1、Rg2和Rh1含量最大值均在枯萎期,分别为7.86mg·g-1、3.02 mg·g-1、1.47 mg·g-1和1.72 mg·g-1,而Rh2出现在果期,为1.24 mg·g-1。和其它4种人参皂苷单体相比较,Re含量均处于较高水平,可见人参皂苷Re为竹节参根的标志性产物。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S567.53

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 邱德有,宋经元,马小军,祁建军,张荫麟;丹参毛状根生物反应器大规模培养的研究[J];分子植物育种;2004年05期
2 张来;杨碧昌;;黔产竹节参不同器官主要营养成分及其相关性[J];贵州农业科学;2006年04期
3 刘家兰,李德清,刘红;竹节人参提取物对实验性心肌缺血的保护作用[J];湖北民族学院学报(医学版);1999年01期
4 刘红;竹节人参提取物抗疲劳的实验研究[J];湖北民族学院学报(医学版);2001年03期
5 彭邦瑜,刘毅,邢宏志;中西医结合治疗Ⅱ型糖尿病94例[J];湖北中医杂志;2001年04期
6 李娜;王世明;陈军;李玉祥;赵明文;;SEFA-PCR法克隆灵芝鲨烯合酶基因启动子及其序列分析[J];菌物学报;2006年04期
7 陈龙全,袁德培,孟卫星,刘红,张万福;复方竹节参片镇痛、抗炎作用的实验研究[J];江苏中医;1998年09期
8 陈永波,饶斌,沈艳芬,程群,唐登梅,赵清华;竹节人参中氨基酸和皂甙特征组分的分析鉴别[J];色谱;2003年03期
9 付春祥,金治平,杨睿,吴风燕,赵德修;新疆雪莲毛状根的诱导及其植株再生体系的建立[J];生物工程学报;2004年03期
10 顿耀艳;袁丁;;竹节参化学成分的研究进展[J];时珍国医国药;2006年10期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 廖志华;紫杉醇前体生物合成的分子生物学和抗癌萜类吲哚生物碱的代谢工程[D];复旦大学;2004年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王玉珍,刘香玲,罗景兰;大叶饲料型刺槐组培技术体系的研究[J];山东农业科学;2005年04期
2 宋振巧,王洪刚,王建华;栝楼的研究进展[J];山东农业科学;2005年05期
3 郜爱民;徐晨光;张瑞明;严平;;凤梨科花卉的组织培养和快繁技术研究[J];安徽农学通报;2005年06期
4 谢小龙,王溪森,赵利,王莉,李毅;黄芪种质资源研究进展[J];安徽农业科学;2005年01期
5 李慧,陈绕生;矮化石楠试管苗移栽基质的筛选[J];安徽农业科学;2005年10期
6 李永丽;周洲;李科友;;细胞培养生产药用次生代谢物研究进展[J];安徽农业科学;2006年02期
7 田英翠;袁雄强;;郁金香组培快繁技术研究[J];安徽农业科学;2006年02期
8 张国强;翟秋喜;;我国植物组培技术的发展及展望[J];安徽农业科学;2006年16期
9 黄顺旺,张静;名贵珍稀的“霍山石斛”[J];安徽医药;2000年03期
10 王祎,杨万年;宜昌百合小鳞茎诱导的初步研究[J];氨基酸和生物资源;2005年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘俊;李继斌;汪洋;;天然植物抗氧化剂及在食品工业中的应用[A];食物功效成分与健康——达能营养中心第九次学术年会会议论文集[C];2006年
2 王蕾;秦智伟;辛明;;酸浆属植物遗传育种研究进展[A];中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C];2006年
3 郑洋;王金刚;龚束芳;樊金萍;车代弟;;唐菖蒲体细胞胚的诱导及植株再生[A];2007年中国园艺学会观赏园艺专业委员会年会论文集[C];2007年
4 郑晓薇;王四清;张伟;;几种肖竹芋的组织培养研究[A];2007年中国园艺学会观赏园艺专业委员会年会论文集[C];2007年
5 伍成厚;陈妙贤;冯毅敏;龙丽萍;朱纯;谈凤笑;叶振华;;印度野牡丹的愈伤组织诱导及植株再生研究[A];2007年中国园艺学会观赏园艺专业委员会年会论文集[C];2007年
6 莫益增;;竹芪口服液结合放疗治疗恶性肿瘤的疗效观察[A];2003全国苗医药学术研讨会特辑[C];2003年
7 陈士林;张晓伟;宋经元;李滢;李晨吉;孙永巧;李西文;姚辉;胡松年;;西洋参表达序列标签(EST)文库构建及其功能分析[A];第九届全国中药和天然药物学术研讨会大会报告及论文集[C];2007年
8 宋经元;吴春颖;陈士林;;EST技术及其在药用植物功能基因挖掘中的应用研究[A];第九届全国中药和天然药物学术研讨会大会报告及论文集[C];2007年
9 于立坚;马润娣;王长秀;黄来珍;张霄瑜;于廷曦;;土贝母苷甲对人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞粘附、侵袭和迁移能力的影响[A];第九届全国中药和天然药物学术研讨会大会报告及论文集[C];2007年
10 王长秀;马润娣;于立坚;;土贝母皂苷对人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞粘附、侵袭和迁移能力的影响[A];2005年全国中药研究暨中药房管理学术研讨会论文汇编[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘俊;基于纳米颗粒的植物转基因及其检测研究[D];湖南大学;2005年
2 张金文;马铃薯块茎抗低温糖化基因工程研究[D];华南热带农业大学;2001年
3 杨永;中国麻黄属植物的分类—兼论麻黄属的演化[D];中国科学院研究生院(植物研究所);2002年
4 朴商均;论中药的双向调节[D];山东中医药大学;2003年
5 魏英勤;中药复方血糖宁有效部位的研究[D];山东中医药大学;2003年
6 杨特武;rolB转基因农垦58S形态、育性表达和内源激素水平变化[D];华中农业大学;2003年
7 李小龙;灯盏花素的心肌保护作用及其机制研究[D];浙江大学;2004年
8 方凤奇;石见穿治疗子宫内膜异位症的实验研究[D];吉林大学;2004年
9 李敏晶;微波辅助萃取中药有效成分的研究[D];吉林大学;2004年
10 王太霞;怀地黄块根的发育与有效成分的积累关系及其道地性形成机制的研究[D];西北大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 杨睿;水母雪莲毛状根培养及黄酮类化合物生物合成的调控[D];中国科学院研究生院(植物研究所);2005年
2 曹锦和;犬用抗疲劳复方添加剂的研制[D];南京农业大学;2006年
3 余艳;南方红豆杉新内生真菌Bionectria sp.的分离、鉴定及代谢物活性分析[D];西南大学;2007年
4 刘兴菊;Ri质粒转化三倍体毛白杨及外源基因表达的研究[D];河北农业大学;2005年
5 彭正云;茶树毛状根的诱导及其培养体系的建立[D];湖南农业大学;2005年
6 田继微;受四环素调控的基因工程雄性不育系统导入水稻的研究[D];湖南农业大学;2005年
7 徐缓;脑得生分散片制备工艺的初步研究[D];黑龙江中医药大学;2005年
8 韩小龙;从枇杷叶中提取、分离熊果酸的工艺研究[D];西北大学;2005年
9 刘春然;高氧液抗运动性疲劳的作用及机制研究[D];第四军医大学;2005年
10 陈文学;胡椒抗氧化物的提取及抗氧化性能研究[D];华南热带农业大学;2005年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王春雷,芦柏震,侯桂兰;熊果酸抗肿瘤作用研究进展[J];安徽医药;2005年10期
2 王先远,金宏,许志勤,高兰兴;苦瓜皂甙降血糖作用及其机制初探[J];氨基酸和生物资源;2001年03期
3 汪建伟,王德才,王永洪,李景银;鸡羽毛制备复合氨基酸铁铵的研究[J];氨基酸和生物资源;1997年01期
4 王志洁,黄铁牛,刘焱文,杨占秋,方学韫;黄芪总皂甙抗HSV_2的实验研究[J];浙江中医学院学报;2001年05期
5 何薇;曾祖平;;知母皂苷及其苷元抗衰老作用的研究进展[J];北京中医;2006年06期
6 乔萍,杨贵贞;三七皂苷单体Rg1对D-半乳糖模型鼠学习记忆和免疫功能的影响[J];吉林大学学报(医学版);2003年03期
7 崔新明,李艳茹,吕文伟,崔丽,刘洁,田建明,李龙云,叶金梅,张志伟,窦莹;人参皂苷Rg2对急性心源性休克犬心肌的保护作用[J];吉林大学学报(医学版);2003年04期
8 王春刚,贾晓晶,董丽华,吴镇凤,龚守良,马兴元,陈燕萍;西洋参叶三醇组皂苷对乳腺癌放疗患者外周血免疫球蛋白、补体水平及淋巴细胞CD4、CD8和CD25表达的影响[J];吉林大学学报(医学版);2005年02期
9 常振战,沈昕,果德安,鲁宽科,王沙生,郑俊华;天山大黄发根培养物中蒽醌化合物的产生[J];北京医科大学学报;1998年05期
10 熊筱娟,陈武,肖小华,徐丽英,崔江龙;乌索酸与齐墩果酸对小鼠实验性肝损伤保护作用的比较[J];江西师范大学学报(自然科学版);2004年06期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 向极钎,杨永康,覃大吉,曾凡忠,廖朝林,由金文,唐春梓;竹节参人工栽培技术研究[J];中药研究与信息;2005年05期
2 黄国启;;鄂西竹节参野生变家种技术总结[J];中药材;1987年03期
3 刘仁林;;竹节参的人工育苗[J];江西林业科技;1992年05期
4 ;开眼界[J];乡镇论坛;2003年09期
5 ;市场信息[J];林业实用技术;2003年05期
6 廖朝林;;鄂竹节参1号[J];农家顾问;2007年05期
7 张国华;黄燕;郭汉玖;由金文;何银生;郭杰;;竹节参肥料试验研究[J];现代农业科技;2007年19期
8 廖朝林;张国华;刘海华;唐春梓;由金文;郭杰;;竹节参种苗密度试验[J];现代农业科技;2008年01期
9 甘国菊;甘国莲;杨永康;唐春梓;林先明;廖朝林;郭汉玖;黄燕;陆敏;刘海华;穆森;;竹节参主要病虫害及其防治[J];农技服务;2008年07期
10 林先明;刘海华;郭杰;由金文;廖朝林;张国华;唐春梓;;竹节参生物学特性研究[J];中国野生植物资源;2007年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王薇;刘越;宋小妹;;竹节参质量评价方法研究[A];中华中医药学会第十届中药鉴定学术会议暨WHO中药材鉴定方法和技术研讨会论文集[C];2010年
2 朱昌兰;贺浩华;贺晓鹏;彭小松;陈小荣;傅军如;欧阳林娟;边建民;胡丽芳;;利用等位基因特异性PCR检测水稻可溶性淀粉合酶SSⅢa基因的单核苷酸多态性[A];中国作物学会50周年庆祝会暨2011年学术年会论文集[C];2011年
3 刘桂林;陈平;;鄂产竹节参活性多糖成分的研究[A];湖北省药学会第十一届会员代表大会暨2007年学术年会论文汇编[C];2007年
4 赵晖;孙建宁;吴金英;贾占红;;竹节参总皂甙对脑缺血再灌大鼠神经细胞凋亡的影响[A];中华中医药学会中药实验药理分会第七届学术会议论文摘要汇编[C];2007年
5 张长城;袁丁;何毓敏;周志勇;;竹节参化学成分与药理作用研究概况[A];药用植物化学与中药资源可持续发展学术研讨会论文集(上)[C];2009年
6 赵晖;;竹节参总皂甙对脑缺血大鼠神经细胞凋亡及早期快速反应基因表达的影响[A];中华中医药学会中药实验药理分会第八届学术会议论文摘要汇编[C];2009年
7 沈忠;;SHLR与SS之间数据同步问题分析[A];武汉市第二届学术年会、通信学会2006年学术年会论文集[C];2006年
8 李鹏飞;;浅谈拥塞控制在NGN中的实现(针对中兴NGN)[A];武汉市第二届学术年会、通信学会2006年学术年会论文集[C];2006年
9 茅淑芳;李宗芸;安婷婷;汤佳立;;基因组原位杂交分析野芥(SS)与芸薹属AA,BB基因组间关系[A];江苏省遗传学会第八届会员代表大会暨学术研讨会论文集[C];2010年
10 茅淑芳;李宗芸;安婷婷;汤佳立;;基因组原位杂交分析野芥(SS)与芸薹属AA,BB基因组间关系[A];北方遗传资源的保护与利用研讨会论文汇编[C];2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 通讯员 胡万庭;椿木营打造竹节参基地[N];恩施日报;2011年
2 江琼;椿木营鼓励发展竹节参[N];恩施日报;2007年
3 记者 薛辉;秋天的牵挂[N];恩施日报;2009年
4 贺永红;全州开展中药材灾后自救[N];恩施日报;2008年
5 曹厚俊黄长安;施家坪通村路带活农村经济[N];恩施日报;2008年
6 赵仁君 阎友华;恩施州以科技手段促进中药产业化[N];中国经济导报;2005年
7 宋文通讯员 尤浩;宣恩构建生产加工网络[N];恩施日报;2007年
8 宋文通讯员 曹作砚 刘书翰;催生新格局[N];恩施日报;2008年
9 赵仁君;科技部生物中心负责人考察华中药用植物园[N];恩施日报;2008年
10 宋文通讯员 余毅 曾凡忠;村干部最高可拿万元年薪[N];恩施日报;2008年
中国博士学位论文全文数据库 前7条
1 张来;竹节参离体培养与鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因的克隆及代谢研究[D];西南大学;2011年
2 敖明章;竹节参皂苷抗炎抗风湿作用及机理研究[D];华中科技大学;2012年
3 张皓;针刺镇痛机制中内源性SS与信号转导机制的研究[D];山东中医药大学;2010年
4 袁丁;竹节参药效物质及药材质量分析研究[D];湖北中医学院;2009年
5 吴波;糖尿病胃轻瘫与生长抑素和胃泌素的相关性研究[D];中国医科大学;2006年
6 任晓慧;RNA复制子对基因表达的促进作用及动物促生长方法的探讨[D];吉林大学;2007年
7 白莉雅;生长因子及表观修饰对牛卵泡发育的调控及其机制研究[D];华中农业大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 罗正伟;竹节参再生体系的优化及SS基因在烟草毛状根中的功能验证[D];西南大学;2012年
2 贾放;竹节参皂苷类成分的研究[D];武汉工业学院;2012年
3 王如锋;竹节参多糖的提取分离、结构修饰与活性研究[D];武汉工业学院;2012年
4 李春艳;竹节参多糖提取分离和免疫调节及抗肿瘤活性研究[D];中南大学;2012年
5 肖晏婴;竹节参茎叶中脂溶性成分的研究[D];武汉工业学院;2010年
6 殷智;复方竹节参胶囊的药学基础研究[D];湖北中医学院;2004年
7 许佳;竹节参抗急性心肌缺血的药效物质及初步机制研究[D];三峡大学;2011年
8 李兰林;六味竹节参片制备工艺及质量标准研究[D];中南大学;2011年
9 林华;水稻可溶性淀粉合酶基因SSⅡα、SSⅢα等位变异及其与稻米品质的关联分析[D];江西农业大学;2011年
10 宋来良;基于精益生产的SS公司生产周期和库存改善方案设计[D];兰州大学;2011年
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