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《西南大学》 2011年
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大蒜素衍生物对巨噬细胞抗癌作用的调控及其构效关系研究

杨俊峰  
【摘要】:本课题选取以了大蒜素(丙烯三硫醚)为模板合成的四种不饱和的衍生物:二(3-丁烯基)三硫醚、二(3-甲基-2-丁烯基)三硫醚、二(4-戊烯基)三硫醚和二(5-己烯基)三硫醚。比较这五化合物对体外培养的巨噬细胞的刺激活性,并且对小鼠腹腔巨噬细胞分离的刺激药物和温度条件进行筛选,以便最大程度获取巨噬细胞。探究五种化合物在不同浓度下通过调节巨噬细胞内游离钙离子对巨噬细胞的形态,活力和吞噬能力以及对巨噬细胞抗癌作用的细胞因子(白介素-2、肿瘤坏死因子-a和干扰素—γ)和NO, SOD等相关因子的水平的影响产生的抗癌作用,并筛选出药理活性较好的一到两种衍生物。对大蒜素及其衍生物的结构参数进行分析,找出其与生物活性之间的构效关系,为以后合成药理活性以及稳定性更好大蒜素衍生物提供依据。 本实验中用硫代乙醇钠刺激在37℃条件下培养的小鼠能最大程度的获取巨噬细胞。在显微镜下观察发现大蒜素及其衍生物能够活化巨噬细胞使其体积增大。MTT法检测发现浓度低于160μg/mL的大蒜素及其衍生物对体外培养的巨噬细胞活力没有显著性影响,在各浓度组均能不同程度的提高巨噬细胞对中性红的吞噬能力,随着同一化合物浓度的增加,呈剂量依赖性关系。其中二(3-丁烯基)三硫醚效果最好,在160μg/mL浓度下巨噬细胞吞噬中性红用酶标仪在490nm测定OD值为0.270±0.018,与空白组0.120±0.005比较吞噬能力提高2.2倍。 本实验检测了大蒜素衍生物介导的巨噬细胞对PC-3细胞产生细胞毒性,通过对PC-3细胞凋亡率的计算发现在20μg/mL浓度下大蒜素及其衍生物通过巨噬细胞使PC-3细胞凋亡的能力提高不显著,浓度提升到在40μg/mL时,各化合物组对PC-3细胞的凋亡百分率急剧升高,呈剂量依赖性关系,其中二(3-丁烯基)三硫醚、二(3-甲基-2-丁烯基)三硫醚在最高浓度下的凋亡率都在85%以上。用酶联免疫试剂盒检测巨噬细胞因子(IL-2、TNF-a和IFN—γ)的分泌量,结果表明在20μg/mL浓度下IL-2、TNF-a和IFN—γ的分泌量都没有显著的增加,随着同一化合物浓度的增加,分泌量有不同程度的增加,呈剂量依赖性关系,化合物对IL-2、TNF-a的增加刺激效果显著,IFN—γ除在160μg/mL浓度下刺激性显著外,其他浓度效果不显著。用Griess法检测细胞培养上清液中NO2-的量,来间接反映巨噬细胞释放NO的量,在巨噬细胞培养24h和36h下进行检测,结果表明,随着药物作用浓度和时间的增加,NO释放量的上升呈浓度和时间依赖性趋势。用邻苯三酚检测法测定了巨噬细胞SOD水平,化合物在160μg/mL浓度下能够增加SOD的水平。在巨噬细胞内加入Fμra-2,用荧光分光光度仪检测荧光强度,计算细胞内游离钙离子量,结果表明,同一化合物浓度增加到80μg/mL时,巨噬细胞内的游离钙离子浓度呈显著性增加,呈剂量依赖性关系。高于80μg/mL时,巨噬细胞内的游离钙离子有所降低,呈缓慢下降的趋势。 用Chemoffice中的MM2方法对大蒜素及其衍生物进行分子结构能量优化,发现随着大蒜素衍生物碳原子数的增加和碳链的延长,水性参数ClogP值从3.71逐渐增大到5.73,同分异构体二(3-甲基-2-丁烯基)三硫醚的ClogP大于二(4-戊烯基)三硫醚;HF和总能量逐渐减小,同分异构体二(3-甲基-2-丁烯基)三硫醚HF值为30.61比二(4-戊烯基)三硫醚19.28几乎高一倍,总能量却几乎相同。与前面研究药理活性结果比较,当ClogP值大于4.8时,继续延长碳链对大蒜素衍生物的药理活性没有提高,同分异构体之间HF越大,其衍生物生物活性越大。分子总能量随着碳链的延长逐渐减小,衍生物的稳定性可能会提高。 综上所述,大蒜素及其衍生物能够刺激巨噬细胞的抗癌能力,在160/ug/mL浓度下对细胞的体外生长无毒副作用,在各浓度下均能提高巨噬细胞的吞噬和使癌细胞凋亡的能力。主要通过活化巨噬细胞,提高细胞内钙离子的水平,介导细胞的细胞因子IL-2、TNF-a,和NO, SOD的浓度来发挥抗癌作用,IFN—γ在此过程中水平升高不显著。从实验数据得出,二(3-丁烯基)三硫醚、二(3-甲基-2-丁烯基)三硫醚的药理活性较好,可以对其在制作免疫增强剂和抗癌剂方面进行深入的研究。从构效关系来看,疏水参数,生成热(HF),总能量的大小变化规律对大蒜素衍生物的合成有一定的参考价值。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R285.5

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