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《西南大学》 2011年
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细胞色素CYP3A11 knock-down小鼠的表达检测及表型分析

赵从  
【摘要】：细胞色素P450 (cytochrome, CYP450)是参与药物代谢的一类非常重要的代谢酶,在多种内源性和外源性物质的生物代谢中起着重要作用。大约60%的普通处方药都需要通过P450酶进行生物转化。CYP3A是CYP450中最重要的亚家族成员之一,参与内源性物质的生物合成、代谢以及外源性物质的氧化代谢。据国外研究报道在CYP3A亚家族中,CYP3A11是小鼠含量最丰富的亚型,且是小鼠肝脏表达量最高(占小鼠肝脏P450酶总体表达量的20%)、代谢活性最强的P450酶,然而其在药物代谢中的作用还没有完全被世人所知。为了充分发挥药物疗效,减少或避免不良反应的发生,需要对CYP3A11的表达进行更深入的研究。 Knock-down是在药物代谢研究中应用最广泛的特异性改变蛋白表达的一类新技术。本文在前期采用该技术制备的CYP3Allknock-down小鼠基础上,以单线法连续繁殖至第3代的近交系小鼠为实验动物,通过RT-PCR、FQ-PCR和微粒体外孵育等分子生物学方法研究了CYP3A11转基因小鼠在连续传代过程中的表达情况、miR-shRNA对CYP3A11转基因小鼠的干扰效率和CYP3A11转基因小鼠表型分析,为以后利用慢病毒载体制作其它小鼠模型和大型转基因哺乳动物提供理论依据,同时为建立代谢谱更广、适用范围更大的P450酶人源化转基因小鼠奠定基础。研究主要结果如下： 1.采用PCR和RT-PCR相结合的方法定性鉴定了连续3代转基因小鼠的阳性率。结果表明：单线近交繁育的转基因小鼠阳性率和表达率均为100%,此结果说明转基因动物在单线近交繁殖群体中并未出现基因分离现象,可以通过此方法建立稳定的阳性转基因品系。 2.紫外灯下可观察到小鼠耳廓皮肤及尾巴的EGFP特征性绿色荧光,该结果表明目的基因已在小鼠体内表达。 3.通过荧光定量PCR分析,结果显示在肝脏中miR-shRNA对CYP3A11转基因小鼠的干扰效率最高可达80%左右,表明由慢病毒介导的miRNA分子也得以表达并因此显著地减少了目的基因的表达。 4.对CYP3A11基因knock-down小鼠表型分析采用肝脏微粒体体外代谢活性检测方法,结果发现knock-down小鼠的肝脏微粒体对CYP3A11酶的经典底物6β-羟基睾酮的代谢活性比对照组降低了80%以上；表达无关对照shRNA转基因小鼠与正常FVB/N小鼠的CYP3A11酶的体外代谢活性无显著差异,表明慢病毒介导的转基因过程对CYP3A11酶的活性无显著差异,与基因表达的降低幅度相当。 综上所述,得到以下结论： 1.利用konck-down技术建立起来的转基因动物通过单线法近交繁殖,在转基因后代群体中未出现基因分离现象,因此该繁育方法可以用来建立阳性转基因品系。 2.慢病毒介导技术显著地减少目的基因的表达,为制备CYP3A亚家族人源化小鼠奠定了技术基础。
【关键词】：小鼠 细胞色素P450 CYP3A11 FQ-PCR EGFP基因 表型分析
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：Q559.9
【目录】：
  • 摘要7-9
  • Abstract9-13
  • 第一章 文献综述13-22
  • 1.1 细胞色素P450简介13-16
  • 1.1.1 P450的分类和分布13
  • 1.1.2 CYP450的命名13-14
  • 1.1.3 CYP450与药物的相互作用14-15
  • 1.1.4 细胞色素P450的功能15-16
  • 1.2 CYP3A11的简介16
  • 1.3 FQ-PCR简介16-22
  • 1.3.1 原理17-18
  • 1.3.2 荧光定量PCR技术的主要类型及特点18-19
  • 1.3.3 实时荧光定量PCR技术的优缺点19-20
  • 1.3.4 FQ-PCR的应用20-22
  • 第二章 引言22-23
  • 第三章 材料与方法23-30
  • 3.1 实验材料23-24
  • 3.1.1 实验动物23
  • 3.1.2 主要试剂及配制方法23-24
  • 3.1.2.1 主要试剂23-24
  • 3.1.2.2 主要试剂的配制方法24
  • 3.1.4 主要设备和器材24
  • 3.2 实验方法24-30
  • 3.2.1 CYP3A11基因沉默小鼠基因组DNA的质量检测和纯化24-25
  • 3.2.2 基因沉默CYP3A11小鼠的PCR鉴定25-26
  • 3.2.3 FQ-PCR检测干扰效率26
  • 3.2.4 小鼠肝脏总RNA的提取26-27
  • 3.2.5 mRNA的逆转录27
  • 3.2.6 FQ-PCR27-28
  • 3.2.7 定量计算28
  • 3.2.8 转基因小鼠的传代情况28
  • 3.2.9 CYP3A11基因knock-down小鼠表型检测28-29
  • 3.2.10 表型分析实验方法29-30
  • 第四章 结果与分析30-38
  • 4.1 CYP3A11转基因小鼠的荧光观察及阳性表达率30-31
  • 4.1.1 CYP3A11转基因小鼠的活体荧光检测30
  • 4.1.2 PCR鉴定CYP3A11转基因小鼠的阳性表达率30-31
  • 4.2 小鼠CYP3A11基因沉默效率的检测31-37
  • 4.2.1 提取所得总RNA的结果31-32
  • 4.2.2 荧光定量PCR结果32-37
  • 4.3 CYP3A11小鼠的表型检测结果37-38
  • 第五章 讨论38-40
  • 5.1 EGFP基因表达38
  • 5.2 干扰效率38
  • 5.3 FQ-PCR优化38-39
  • 5.4 表型分析39-40
  • 第六章 结论40-41
  • 参考文献41-46
  • 致谢46-48
  • 攻读硕士期间发表论文情况48

【参考文献】
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