柑橘杂种胚组织培养挽救及分子标记早期鉴定技术研究

【摘要】：柑橘杂交育种是培育优良柑橘品种的主要方法之一。但由于绝大多数柑橘品种存在珠心胚现象,杂交后常常引起杂种胚退化或者败育,限制了很多具有优良性状的多胚性品种为亲本的杂交育种。杂种鉴定方面,传统的形态鉴别法、同工酶鉴别法等方法,不适合在胚早期进行杂种鉴定。DNA分子标记技术在杂种胚鉴定上优势明显,可在杂种胚发育早期进行鉴定,并具有准确性和可信度高等优点。因此建立一种高效的杂种胚挽救和鉴定方法,可在一定程度上克服珠心胚现象对杂交育种的干扰,对提高柑橘杂交育种效率、缩短育种周期具有重要意义。 本研究以锦橙×红橘和红橘×锦橙杂交组合为研究对象,首先明确了珠心胚入侵时间,确定进行胚挽救的最佳时间。离体诱导成胚后,应用DNA微量提取技术,提取胚材料DNA,利用SSR分子标记技术进行杂种胚鉴定,从而建立一种高效的杂种胚挽救和鉴定方法,主要结果如下： 1.最佳离体培养时间 在杂交授粉55 d后,每隔5 d在显微镜下观察胚胎的发育情况,确定珠心胚开始入侵胚囊的时间。当观察到胚囊中开始有胚形成时,每隔5 d取幼胚进行离体培养,通过观察离体培养胚的发育情况,确定进行胚挽救的最佳时间。研究结果表明,对于锦橙×红橘和红橘×锦橙杂交组合,进行杂种胚挽救的最佳时间分别为授粉后85 d和90 d。 2.用于SSR分析所需胚材料最少取样量确定 利用CTAB法,对不同量胚材料(20 mg,10 mg,5 mg)提取DNA进行SSR分析。结果表明,仅用5 mg胚材料就能提取足够用于SSR分析的基因组DNA,适合于杂种胚早期分子鉴定。 3.多态性引物筛选 分别以红橘和锦橙DNA为模板,从20对引物中筛选可用于杂种胚早期鉴定的SSR引物。结果表明,引物SS4、Cssr036和Cssr051适用于锦橙×红橘杂种胚的SSR鉴定；而引物SS16、Cssr037和Cssr051适用于红橘×锦橙杂种胚的SSR鉴定。 4.杂种胚鉴定 以最小取样量分别切取离体培养胚材料,利用筛选的SSR引物和优化的PCR反应条件对培养获得的胚材料进行SSR分析,从46个锦橙×红橘的离体胚挽救材料中筛选出9个杂种胚,从32个红橘×锦橙的离体胚挽救材料中中筛选出7个杂种胚。 综上所述,本研究通过显微镜观察授粉后胚胎发育情况和离体培养胚的生长情况,确定杂种胚挽救的最佳时间,结合DNA微量提取和SSR分子标记技术,可在胚发育早期完成杂种胚的鉴定,大大提高了柑橘杂交育种效率。

【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：S666