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《西南大学》 2012年
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柑橘类病毒的鉴定及其小RNA的深度测序分析研究

曹孟籍  
【摘要】:类病毒是一类246-401-nt大小的,闭合环状的,单链小分子RNA。类病毒能在寄主植物体内复制,是一种重要的植物病原。柑橘是七种柑橘类病毒的自然寄主。它们分属于马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae)的四个属。其中柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid, CEVd)属于马铃薯纺锤块茎类病毒属(Pospiviroid);啤酒矮化类病毒(Hop stunt viroid, HSVd)属于啤酒花矮化类病毒属(Hostuviroid);柑橘树皮裂纹类病毒(Citrus bark cracking viroid, CBCVd)属于椰子死亡类病毒属(Cocadviroid);柑橘曲叶类病毒[Citrus bent leaf viroid, CBLVd (包括CBLVd的特定株系,CVd-Ⅰ-LSS)],柑橘矮化类病毒(Citrus dwarfing viroid, CDVd),柑橘类病毒Ⅴ (Citrus viroid V, CVd-V)和柑橘类病毒Ⅵ (Citrus viroid VI, CVd-VI)属于苹果锈果类病毒属(Apscaviroid)。 CEVd和HSVd(?)勺特定株系分别是柑橘裂皮病和柑橘木质陷孔病的病原,对柑橘生产造成严重危害。 (1)柑橘是中国南方15个省份(自治区、直辖市)最重要的经济作物之一,栽培面积广阔。枳和枳橙是各产区多数柑橘品种使用的砧木。然而枳和枳橙对柑橘类病毒十分敏感,容易造成严重的类病毒病害。本研究从重庆、四川、浙江江西、湖南和云南等6个柑橘主产区采集了42份柑桔类病毒毒源样品。重点从砧木树皮纵向开裂、树皮变色充胶及植株矮化的柑桔村上采样。将毒源材料嫁接到'Etrog'香橼‘861-S-1’选系上,12个月后,42份样品中,39份样品嫁接的指示植物表现出典型的类病毒症状,如卷叶和矮化。 本研究提取香橼叶片的总RNA后,通过一步法多重RT-PCR同时检测CEVd, CBLVd, HSVd和CDVd四种类病毒,使用一步法RT-PCR单独检测CBCVd, CVd-Ⅴ, CVd-Ⅵ和CVd-Ⅰ-LSS。检测结果表明,CEVd, CBLVd, HSVd, CDVd, CBCVd, CVd-Ⅴ, CVd-Ⅵ和CVd-Ⅰ-LSS分别在13、14、37、35、2、3、8和2个样品中检测呈阳性,阳性率分别为31.0%,33.3%,88.1%,83.3%,4.8%,7.1%,19.0%和4.8%。42份样品中,有36份样品被多种类病毒复合侵染。通过生物学检测发现,即使没有CEVd的侵染,其他几种类病毒复合侵染香橼时,也能引起与CEVd相类似的症状。通过田间症状观察发现,即使没有CEVd,其它种类的柑橘类病毒复合侵染也能在枳砧木上引起典型的裂皮病症状。这暗示了,在中国的柑橘产区,部分与裂皮病相类似的病害是由非CEVd的多种柑橘类病毒复合侵染造成的。 通过对每种类病毒代表分离物全长序列克隆测序发现,CEVd在眉山9号样品的分离物是强毒株系CEVd-E117。三个CBLVd分离物中,有一个是CVd-Ⅰb株系,另外两个是CVd-Ⅰa株系。HSVd只分离到了CVd-Ⅱa株系,没有发现木质陷孔病的病原CVd-Ⅱb或者CVd-Ⅱc株系。三个CDVd分离物中,有一个是CVd-Ⅲb,另外两个被CVd-Ⅲa和CVd-Ⅲb混合感染,没有发现CVd-Ⅲc株系。 将在中国分离到的CBCVd, CVd-Ⅴ, CVd-Ⅵ和CVd-Ⅰ-LSS序列与目前已报道的相应序列一起构建进化树。结果表明:(a)所有的CBCVd和CVd-Ⅰ-LSS序列,根据一定序列差异分别归于两个主要的群体;(b)所有的CVd-Ⅴ序列根据一定的地理分布归于两个主要的群体;(c)所有的CVd-Ⅵ序列根据一定的寄主差异归于三个主要的群体。本研究是CBCVd, CVd-Ⅴ, CVd-Ⅵ和CVd-Ⅰ-LSS在中国的首次报道。 (2)巴基斯坦是世界十大柑橘产区之一,特别以'Kinnow'宽皮柑橘的生产闻名于世。巴基斯坦柑橘的产量有96%集中于Punjab省。本研究从巴基斯坦Punjab省的三个柑橘主产区Sargodha, Bhalwal和Faisalabad的果园采集了34份柑桔类病毒毒源样品。使用一步法多重RT-PCR同时检测CEVd, CBLVd, HSVd, CDVd和CBCVd五种类病毒。CEVd, CBLVd, HSVd和CDVd分别在12、8、31和17个样品中检测为阳性,阳性率分别为35.3%,23.5%,91.2%和50.0%,未检测到CBCVd。34份样品中有23份被多种类病毒复合侵染。 对每种类病毒代表分离物全长序列克隆测序表明,所有的CBLVd序列都属于CVd-Ⅰa株系。大部分HSVd克隆是CVd-Ⅱa株系,其中一个克隆是具有木质陷孔病决定因子的CVd-Ⅱb,没有发现CVd-Ⅱc株系。大部分CDVd克隆是CVd-Ⅲb株系,没有发现CVd-Ⅲa和CVd-Ⅲc株系,同时发现了不同于这三个株系的CDVd新群体。这是CEVd, CBLVd, HSVd和CDVd在巴基斯坦的首次分子报道,同时也是首次在该地区分离到木质陷孔病的病原。 (3)CVd-V是最近才鉴定到的一种新的柑橘类病毒,正式归类于马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae),苹果锈果类病毒属(Apscaviroid)。本研究从巴基斯坦Punjab省检测到334份CVd-V阳性柑橘样品,阳性率高达93%,这是CVd-Ⅴ在该国的首次报道。对7种代表性品种样品进行生物学鉴定和所有种类柑橘类病毒的RT-PCR鉴定,发现这7个样品被多种类病毒复合侵染,其中CVd-Ⅰ-LSS是在巴基斯坦的首次报道,没有检测到CBCVd和CVd-ⅤⅠ。从来自不同产区的11份CVd-Ⅴ分离物中获得了68个独立的cDNA克隆,序列大小为292-295-nt。序列多样性分析发现,来自巴基斯坦的CVd-Ⅴ种群序列多样性与世界上其他地区报道的CVd-Ⅴ种群序列多样性相一致。通过遗传多样性和进化树分析,目前世界上所报道的CVd-Ⅴ被分为两个主要组群,推测巴基斯坦很可能是CVd-Ⅴ的主要发源地之一。本研究证实了,CVd-V不是最近才发生的一种类病毒,分布范围比预期要广。本研究丰富了CVd-V的发生、分布和进化起源。 (4)柑橘是七种柑橘类病毒的自然寄主。对柑橘类病毒致病机理方面的研究相对较少。最近的研究表明,来源于类病毒的小RNA在类病毒致病性方面起到了至关重要的作用。因此柑橘类病毒小RNA的鉴定,对理解柑橘类病毒与柑橘寄主的互作机理方面具有重要价值。本研究通过Solexa-Illumina平台对3份感染类病毒和1份健康的香橼叶片样品,进行了小RNA的深度测序。每份样品都被4到6种柑橘类病毒复合侵染,并在香橼上表现出典型的类病毒症状。分析表明:(a)每份样品中所有类病毒的小RNA总读数占样品小RNA总读数的7%左右;(b)不同类病毒,其产生的小RNA来自正负链的比例不同,以21-nt和22-nt大小为主;(c)类病毒小RNA覆盖了类病毒的正负链全基因组,主要集中出现在正负基因组的某些特定的区域。其中CEVd, CBCVd, CVd-V, CVd-VI和CVd-I-LSS负链产生的小RNA主要集中在TR区域的下方。CBLVd, HSVd和CDVd在不同的类病毒组合中具有相似的热点区域。(d)在两份类病毒感染样品中,内源的24-nt小RNA所占比例大幅度下降,而内源的21-nt小RNA所占比例大幅度上升。进一步分析发现,类病毒复合侵染可能诱导了植物内源21-nt miRNAs的积累和24-ntrasiRNAs(?)勺降低。本研究为柑橘类病毒致病机理,特别是复合侵染致病机理的解释提供了新思路。 (5)验证了通过小RNA的深度测序预测未知类病毒。发现了“程序性过滤重叠小分子RNA"(PFOR)程序用于预测类病毒存在特异性和灵敏度上的缺陷,并提出了若干改进措施。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S432.41

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