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《西南大学》 2015年
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在斑马鱼中运用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除及对斑马鱼第二波永久造血作用之初探

张雨  
【摘要】:第一部分斑马鱼(Danio rerio)为原产喜马拉雅山脉东南区域(包括印度、巴基斯坦、柬埔寨等国家和地区)的一种观赏用热带淡水鱼,其作为一种脊椎模式生物被应用于科学研究肇始于1970年代。经过30余年从无到有、由浅及深的认识过程,这种体积小、繁殖快、易于饲养的硬骨鱼类正以其巨大的优势愈来愈被人们所重视。随着斑马鱼基因组测序的全面完成,人们发现至少70%的人类基因在斑马鱼中都存在至少一个同源基因,这使得斑马鱼成为了功能基因组时代最重要的模式生物之一。要研究基因的功能,一个重要的、甚至是首选的做法就是,敲除或者突变该基因,进而研究该基因功能缺失条件下的表现型。定点敲除基因的技术在近几年发展迅速,ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9等基因敲除系统不断涌现,相比于前两者操作繁琐、突变效率低的缺点,CRISPR/Cas9技术以其简便高效的特点成为最近最为流行的基因组定点编辑技术。本研究即是使用CRISPR/Cas9系统针对数个斑马鱼基因做定点敲除并探究其工作条件、工作效率及基因敲除突变体的表现型。首先,作者使用已报道的方法合成人密码子优化的Cas9mRNA和基因特异的gRNA,用不同的剂量注射一细胞时期的斑马鱼胚胎,在1dpf时的死亡率统计显示,高于300pg/胚胎的hCas9 mRNA剂量可引起大量死亡,高于100pg/胚胎的gRNA剂量亦可造成大量死亡。共注射hCas9 mRNA和gRNA时,作者发现低于150pg/胚胎的hCas9 mRNA检测不到突变,高于150pg/胚胎的hCas9 mRNA才可检测到突变,而低于50pg/胚胎的gRNA剂量组亦检测不到突变。由于本实验室积极参加“斑马鱼1号染色体全基因敲除计划”,故具有相当数量的靶点设计及基因敲除实验样本,因此作者对位于斑马鱼1号染色体的基因actala、crfbl7、nupl33和taf5l进行了靶点设计和敲除实验,并结合本实验室其他成员的相关尝试,对其中遇到的工作良好和不工作的设计靶点序列做了简单的统计,找到在靶位点中较重要的位置处的碱基分布倾向性。后以此为原则针对本实验室感兴趣的、和血液发育和免疫应答相关的基因cxcl8a、il10、prdx5设计了CRISPR/Cas9系统工作靶点。结果显示,此规律可一定程度上增加靶点设计的成功几率,但其敲除效率和工作情况也并不稳定。我们猜测该系统的工作效率不仅与其靶向基因组DNA的碱基序列相关,还与其二级甚至三级结构密切相关,这些因素可影响gRNA在基因组DNA上的结合,并进一步影响CAS9的切割效率。截至目前,这7个基因中有两个基因acta1a和nupl33已得到稳定遗传的杂合子二代,有五个基因(crfb17、taf5l、cxcl8a、 il10、prdx5)的FO代仍在饲养中,其突变效率和突变体基因型及表现型尚待探究。第二部分斑马鱼作为一种新兴脊椎模式动物,其通体透明的幼体外观、完全的体外发育过程和简便的遗传操作手段使得它适于运用活体成像和转基因荧光标记等方法来解决科学问题。本实验基于已发现的发生在斑马鱼尾部造血组织的第二波永久造血现象,结合转基因品系Tg(corola:Kaede)和Kaede荧光蛋白可被高频激光改变构象从而改变荧光颜色的特性,对AGM区(产生第一波永久造血作用的生血位点)和CHT(产生第二波永久造血作用的生血位点)产生的HSPCs进行分别标记并行短时追踪,试图以此为切入点找到该两波在时间窗上和发生位置上均相异的造血作用的相同点和区别。通过对11个尾部造血组织(caudal hematopoietic tissue, CHT)区产生的造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cells, HSPCs)进行标记和连续成像追踪,且对93颗来源于主动脉-性腺-中肾区(aorta-gonad-mesonephros, AGM区)和127颗来源于CHT的HSPCs进行标记和间断的荧光镜检追踪,我们发现产自这两波造血作用的HSPCs及其子细胞在幼鱼时期的重要生血和分化位置(如胸腺和肾脏)均有发现,但区别为经历相同时期时,CHT产生的HSPCs相比AGM区产生之HSPCs,更倾向于在原位分裂或静止待命。该区别提示了两波永久造血作用产生的HSPCs可能在个体随后的生命历程中具备不尽相同的发育命运。由于使用Kaede荧光蛋白变色标记法并不能实现较长时间的追踪,两波永久造血阶段产生的HSPCs分别对发育更晚期或成体有什么作用和影响仍然未知,故本实验试图创制转基因斑马鱼品系Tg(corola:LoxP-BFP-STOP-LoxP-GFP),结合实验室已有的斑马鱼品系Tg(kdrl:CreERT2)fb13Tg,以实现在更大的时间和空间尺度标记和追踪产自两个位置、两个时间点的HSPCs及其子细胞。目前,该转基因品系已基本建立成功,其作用尚待后续研究予以认可和利用。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:Q78

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