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《西南大学》 2015年
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基于免标记荧光生物传感器检测蛋白质和小分子的研究

徐云英  
【摘要】:生物传感技术具有许多优点诸如设备简单、价格低廉、响应速度快和灵敏度高等,已经在分析化学、生物化学、生物医学和生物技术等领域中引起了人们的高度关注。其中,利用荧光信号作为检测手段的荧光生物传感器在基因测序、环境监测和医药等领域的应用引起了广大科研工作者的广泛兴趣。蛋白质和小分子的检测对疾病诊断、营养健康分析及临床研究具有十分重要的意义。因此,对蛋白质和小分子等人体内物质的分析一直是现代分析化学非常重要的研究课题。如何利用荧光生物传感技术实现对蛋白质和小分子快速、灵敏和精确的检测仍是生物医学和分析化学工作者的追求。本文基于当前的研究现状,结合信号放大技术,使用荧光染料作为标记物发展了一些新的荧光生物传感技术,实现了对蛋白质和小分子的高灵敏检测,研究内容具体如下:1.基于酶催化目标物循环放大诱导发卡适体结构的改变构建免标记荧光传感器灵敏检测ATP在本实验中,我们展示了一个新的免标记、简单灵敏的荧光ATP检测传感器,该方法是基于核酸外切酶Ⅲ(Ⅲ酶)催化的目标物循环放大(ECTR)策略,利用SYBR Green Ⅰ作为荧光指示剂,在ATP存在时,发卡结构的适体链构型发生改变构建成新的发卡结构,该新构型将被Ⅲ酶水解,同时释放出的目标物ATP引发下一个循环。如此目标物循环过程将水解大量的发夹结构适体探针,导致发夹结构茎部中SYBR Green Ⅰ嵌入量的减少,荧光发射强度的急剧减少。该方法用于ATP的灵敏检测,其检测限可低至纳摩尔级别。由于ATP和适体之间高效特异的亲和力,该方法对于ATP的类似物分子展示了非常好的选择性。此外,该ATP检测方案简单稳定,不需要标记适体探针,并且适用于均相检测,使得其在检测其他小分子方面具有很大的应用潜能。2.基于小分子链接单链DNA的终端保护用于免标记荧光检测叶酸受体在这个工作中,基于叶酸连接单链DNA的终端保护和荧光染料SYBR Gold,我们发展了一种免标记的荧光方法用于检测叶酸受体。目标物叶酸受体和连接叶酸的单链DNA的结合可以保护该单链DNA不被核酸外切酶Ⅰ(Ⅰ酶)水解。受终端保护没有被水解的单链DNA与荧光染料SYBR Gold结合产生强烈的荧光,基于此检测叶酸受体,检测限能达到30 pM。此外,该方法也展示了良好的选择性,且避免了DNA探针的荧光标记。在以上优点的驱动下,通过使用不同的小分子配体和蛋白质受体,该方法在检测其他蛋白质方面具有很大的应用潜能。3.基于Toehold链置换引发G-四链体DNA组装的非酶免标记荧光检测凝血酶基于一种新的信号放大技术即toehold链置换引发G-四链体DNA循环组装,我们发展了一种免标记的非酶传感器用于高灵敏的荧光检测凝血酶。目标物凝血酶能够和其相应的适体结合并且释放出作为引发序列的单链DNA,该引发序列能够引发两端含有封闭G-四链体结构的发夹探针的toehold链置换,导致DNA组装,且两端形成G-四链体结构。toehold链置换的反应导致引发序列的循环再使用并且产生许多含有G-四链体结构的DNA双链。荧光染料NMM能够特异性的和G-四链体结构结合并且释放出强烈的荧光信号。我们的实验能够非常灵敏的检测目标物凝血酶,灵敏度能够低至5pM,并且显示了非常好的选择性。该方法即没有使用标记的探针,也避免酶用于信号的放大。鉴于其成功的检测凝血酶,通过改变适体,我们可以将其用于简单、低消费、灵敏和高选择性的检测其他相应的目标物。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:O657.3;TP212.3

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