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抗感向日葵品种对接种黑茎病菌的生理响应差异

米瑶  
【摘要】:菊科植物向日葵具有较高的经济和食用价值,也是我国重要的油料作物之一。近些年来,随着我国从国外引进向日葵种子量的增多,增大了其种子上携带的多种危险性病害传入我国的风险。向日葵黑茎病(Leptosphaeria lindquistii)是向日葵的一种重要检疫性真菌病害。椐报道,此病害在我国新疆等局部地区时有发生。目前,世界各国对向日葵黑茎病的研究多集中在形态鉴定和和分子检测等方面,虽然有田问不同向日葵品种对黑茎病抗性的调查统计分析,但对于黑茎病菌侵染向日葵后的生物胁迫生理响应的研究报道甚少。抗感向日葵品种在控制条件下,对接种黑茎病菌的生理响应差异研究,如抗氧化酶系统活性、活性氧产生能力、抗氧化酶酶谱的变化及其与抗病性的相关性还未见有报道。本研究选择对黑茎病易感(康地KWS3O3)和高抗(MT792 G)的向日葵品种,在控制条件下对其幼苗期接种我们从新疆田间分离并经ITS分子鉴定了的黑茎病分离物(BXC1),研究抗感品种对黑茎病分离物的生理响应差异。对在人工生长箱萌发生长至出现2片真叶(大约2周)的幼苗的下胚轴接种菌龄1周的BXC1培养物。接种方式有无损伤接种、针刺损伤接种,同时设置无损伤非接种和损伤非接种两个对照。接种后继续培养10天后观测记录感染情况(染病率及病斑大小统计),以比较抗感向日葵品种不同接种方式的感染情况;并对其进行基于ITS的向日葵黑茎病双重PCR分子检测实用化研究,从分子水平确证黑茎病的感染,以便进行后续生理响应差异研究;对各种接种处理的植株各部(根、茎和叶)的酶类(SOD、POD、CAT、PAL和GSH-Px)活性、活性氧(O2-、·OH、H2O2)水平以及同工酶(SOD、POD口EST)谱进行了分析。主要结果如下:1.了解了不同接种方式对向日葵抗感品种感病的差异分析向日葵抗感品种在苗期控制条件下,以不同接种方式接种黑茎病菌BXC1 10d后的病斑特点、感病率、病斑大小(长、短径)发现,针刺损伤接种更易使向日葵感染黑茎病;在相同接种模式下,向日葵感性品种产生黑茎病病斑较抗性品种的黑茎病病斑颜色更深、感病率更高、病斑更大;同时发现向日葵对黑茎病菌的抗性是部分抗性;黑茎病菌株BXC1对向日葵抗感品种的有效接种方式为针刺损伤接种,这为后期研究抗感向日葵对黑茎病的生理响应及抗性生理机制奠定了基础。2.建立起了基于ITS的向日葵黑茎病双重PCR实用检测体系由于目前国内外对向日葵黑茎病的检测主要是根据其形态来进行鉴定,依据其ITS及actin基因的传统和多重PCR分子检测也有报道,但大多采用的是分离纯化的菌株进行的检测方法探索,未对其检测灵敏度及组织带菌检测的实用化进行研究。本研究采用我们从新疆田间分离并经ITS序列扩增、测序鉴定了的黑茎病菌株BXC1为供试菌,进行了其双重PCR分子检测、灵敏度试验以及模拟带菌组织的分子检测,然后用此菌株采用不同接种方式人工接种两种向日葵品种幼苗,待其出现典型症状时,对其进行双重PCR实际检测。结果表明,无论是黑茎病菌基因组DNA还是其与向日葵基因组的混合DNA都能扩增出真菌的ITS区特异带(580bp)和黑茎病菌actin基因的特异带(255bp),且混合DNA还能扩增出向日葵的ITS特异带(约740bp)。说明向日葵黑茎病菌的此种双重PCR分子检测方法具有很好的特异性;梯级稀释真菌DNA或向日葵基因组DNA或其混合DNA模板的双重PCR检测表明,在20μPCR反应体系中,黑茎病菌DNA的检测灵敏度均为0.05 ng/gL;凡是接种了BXC1的向日葵,其带菌组织DNA均能检测出向日葵与黑茎病的ITS序列以及黑茎病actin基因特异条带。这些结果表明,此向日葵黑茎病菌的双重PCR检测体系特异、可靠、便捷,可对带菌向日葵组织进行直接快速分子检测。3.抗感向日葵品种接种黑茎病菌后对重要酶类活性的响应差异试验表明,抗感向日葵接种了黑茎病分离物BXC1的幼苗的根、茎和叶中SOD、POD、CAT、 PAL、GSH-Px的活性都显著高于相应对照组,损伤接种要高于无损伤接种。可见这些酶类是向日葵对黑茎病菌响应酶类,与向日葵对黑茎病的部分抗性有着密切的关系。4.抗感向日葵品种接种黑茎病菌后活性氧水平的差异抗感向日葵接种了黑茎病分离物BXC1的幼苗的根、茎和叶中产生的活性氧(超氧自由基、羟基自由基和过氧化氢)均有所降低,这些活性氧水平的变化与其相关抗氧化酶的活性变化趋势基本一致,且抗性向日葵的降低幅度要比感性向日葵的降幅要大,这也许是抗性的可能原因之一。5.抗感向日葵品种接种黑茎病菌后酶谱差异分析初步认为,SOD酶带S3的活性强弱很可能与向日葵对黑茎病菌的响应和抗性有关;在出现病症的茎中,感性品种接种后POD酶谱出现了P3带,同时P2和P3两条带活性明显较对照增强。抗性品种有特异的活性较强的P4和P5两条带,且随损伤接种强度的增加, P2、P4和P5的活性逐渐增强。初步认为,P4--5的活性强弱很可能与向日葵对黑茎病菌的抗性有关,而P2和P3可能与向日葵对黑茎病菌的响应有关;EST同工酶谱分析表明,在出现病症的茎中,感性品种出现了E3、E5、E6带,且接种处理后,谱带有所增强,而抗性品种只有E5和E6两条带,随着接种处理谱带明显增强,且谱带活性明显高于感性品种,E3,E5和E6可能和抗、感品种对黑茎病的病理响应和抗性有关。6.黑茎病菌菌丝的酶活性、活性氧含量及酶谱特点向日葵黑茎病分离物BXC1菌丝具有较高的SOD和非常高的GSH-Px酶活性,但其POD、CAT和PAL的活性却非常低。BXC1菌丝有较高的超氧自由基产生能力、较高的.OH浓度和非常高的H202含量,这可能是菌丝具有非常低的POD和CAT活性和其·OH/H202含量很高的原因,这也极有可能是其侵染伤害向日葵使其致病的原因之一。黑茎病BXCl菌丝也表现出2条SOD谱带(SLL1和SLL2)和6条EST谱带(E1-6),其中有三条带比较强(E3,E5和E6),但却没有检测到有POD酶谱带。这与活性测定时菌丝含有较高的SOD活性、而其POD活性极低是一致的;有趣的是,在菌丝中存在的2条SOD谱带,在感病病症部的茎中却没有出现,很有可能,在PDA培养基上生长的菌丝与侵入宿主体内的菌丝生长存在差异,这也许是宿主对侵入菌丝的响应或抵抗的缘故。这些问题有待于进一步研究确定.


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