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四氯苯醌激活HepG2细胞Nrf2/ARE信号通路的机制分析

苏传洋  
【摘要】:四氯苯醌(TCBQ)是工业除草剂五氯酚的代谢产物,其体内外模型已显示出活性氧机制诱导的肝毒性和遗传毒性作用。Nrf2/ARE信号通路在机体内的抗氧化过程中发挥重要作用,它可以有效诱导Ⅱ相解毒酶及抗氧化蛋白的表达。Keap1和Bach1均是机体内Nrf2/ARE信号通路的重要转录抑制因子,在Nrf2通路的激活中发挥重要作用。该研究的目的是为了分析TCBQ能否激活Nrf2/ARE信号通路,并探讨其具体的激活机制,可以为TCBQ诱导毒性干预的治疗提供依据。第一部分:Nrf2/ARE信号通路的激活需要Nrf2和Keap1的解离,该部分的研究分析了TCBQ能否激活Nrf2信号通路,并分析了Keap1在Nrf2信号通路激活中的重要作用。HepG2细胞在使用TCBQ给药后,发现Nrf2及抗氧化蛋白HO-1、NQO1的表达上调,并存时间和剂量依赖关系。免疫荧光实验同样证明了TC BQ作用后Nrf2表达的上调。q RT-PCR实验显示了Nrf2而非Keap1基因表达水平的上调。Western Blot分别检测细胞核、质蛋白内Nrf2的变化,清晰证明了Nrf2由细胞质转移进入细胞核的过程。双荧光素酶实验显示了Nrf2入核后,和ARE信号元件结合,并诱导抗氧化蛋白的表达,这可能作为TCBQ中毒后的抗氧化效应。Keap1依赖的Nrf2通路激活机制是目前研究的重点。氧化还原型电泳结果显示TCBQ促使了Keap1交联二聚体的形成,免疫共沉淀实验显示它并没有诱导Keap1和Cullin3的解离,泛素化实验显示TCBQ诱导了泛素分子由Nrf2向Keap1的转移。Keap1交联二聚体的形成及泛素分子的转移均会引起其构象的改变,促使Nrf2从Keap1上释放并入核,进而激活Nrf2/ARE信号通路。第二部分:和Keap1类似,Bach1是Nrf2的另一重要转录抑制因子,可以与Nrf2竞争同ARE抗氧化元件结合,进而调控抗氧化蛋白的表达。该部分研究的主要目的是探讨Bach1在TCBQ诱导Nrf2/ARE信号通路激活中的作用。Western Blot和免疫荧光实验清晰证明了TCBQ给药后,Bach1在1 h内即完成了出核的过程,并伴随着Nrf2的逐渐入核。免疫共沉淀实验证明了TCBQ诱导Bach1的出核依赖于Bach1和Crm1受体结合以及酪氨酸磷酸化作用。ChIP实验证明了TCBQ作用于细胞后,Nrf2和Bach1竞争性的与ARE结合。泛素化实验显示了Bach1出核后,在细胞质内经泛素化作用而降解。qRT-PCR实验证明了TCBQ增加了Bach1的转录水平,通过加入放线菌酮(CHX)后进行Western Blot检测,证明了3 h后,Bach1的重新合成并入核。Bach1作为Nrf2/ARE信号通路的重要调节基因,其转录水平上调及新的合成使得TCBQ诱导的氧化应激状态逐步恢复。通过干扰RNA和Western Blot实验证明了JNK-P62途径也参与了TCBQ诱导的Nrf2信号通路的调节。


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