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《西南大学》 2017年
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E3泛素连接酶LRSAM1的自缔结和活性调控

卞维祥  
【摘要】:泛素化是一种重要的蛋白翻译后修饰形式,它在真核生物的许多生理过程中发挥重要的调控作用,如蛋白降解,DNA损伤修复,免疫应答,信号传导,自噬,凋亡等。泛素化过程涉及三种酶,即E1泛素激活酶,E2泛素结合酶和E3泛素连接酶。通过这三种酶的依次级联传递,最后把泛素分子连接到特异性底物蛋白上。其中E3泛素连接酶在这个过程中起关键性的特异性识别作用。目前已知的人类E3泛素连接酶约有600种,它们主要分为三大类:RING型(包括RING-like型,如U-Box和PHD等)、HECT型以及RBR型。主要区别是RING型E3调控泛素分子向底物的转移是直接的,HECT型需先转移到自身的活性半胱氨酸上,再转移至底物,是一个间接的过程。RBR型E3含有多个RING结构域,转移泛素机制与HECT型类似。LRSAM1属于RING-finger型E3泛素连接酶,拥有典型的C3HC4结构。全长LRSAM1拥有723个氨基酸,包含有一个LRR结构域,两个CC结构域,一个SAM结构域和一个与活性相关的RING结构域。RING结构域与其E3活性有关,但是对其它结构域的功能作用知之甚少。并且与其它E3蛋白相比,LRSAM1蛋白的结构,功能,活性调控,定位,信号传导等有待进一步深入研究。对LRSAM1分子自我活性调控研究是对后期一切功能和结构研究的基础,但是目前尚未有关LRSAM1蛋白的活性调控的报道。我们制备并纯化了LRSAM1的多克隆抗体,对其特异性和效价进行了评估,并用于后期活性调控实验。随后从其结构域入手,通过体外泛素化重组实验和哺乳细胞表达重组实验,分析了LRSAM1 E3活性调控过程。我们用原核表达系统表达并纯化了高纯度的不含冗余tag的全长LRSAM1蛋白作为抗原,免疫新西兰大白兔获得抗体血清。用溴化氰活化的琼脂糖交联LRSAM1抗原蛋白,通过亲和层析的方法纯化LRSAM1多克隆抗体,对其特异性进行检测表明其特异性良好,为后期实验研究奠定了基础。许多E3连接酶都能形成分子间的寡聚以调控其E3功能或者活性。通过戊二醛交联试验,我们发现LRSAM1分子间也存在自缔结现象。体外实验中失活的LRSAM1ΔRING可以被野生型LRSAM1WT识别并泛素化。细胞过表达两种标签的LRSAM1,可以通过IP证明LRSAM1的分子间相互作用。为寻找LRSAM1分子间相互作用的最小区域,通过分子间泛素化实验,我们发现LRR和CC1结构域能被另一LRSAM1分子泛素化。其中LRR可被单泛素化而CC1可被多泛素化,LRR结构域含有13个保守的赖氨酸,但是它只发生了单一的泛素迁移带,为探明此单泛素化位点,我们构建了LRR的赖氨酸突变体,通过对13个赖氨酸突变体的泛素化情况分析,结果表明赖氨酸不是LRR结构域的泛素化位点。最终通过两个独立的NH2基团封闭实验表明LRR结构域的单泛素化位点发生在N端的α-NH2上。对构建的LRSAM1氨基端缺失突变体的活性检测时发现,其N端串联的结构域有明显增强LRSAM1 E3活性的作用。当LRSAM1只保留其最小活性组件RINGfinger结构域时,在相同浓度条件下,RING结构域的活性几乎检测不到,当其浓度提高至20倍时检测到泛素梯度带。当RING结构域与其N段结构域串联,其活性不断增强,并且LRSAM1ΔLRR和LRSAM1活性相当。体外实验中除分子间泛素转移被检测到外,我们还发现非活性LRSAM1蛋白的加入极大的减弱了与之重组的LRSAM1蛋白的活性,但是对野生型和LRSAM1ΔLRR没有此种作用。为进一步探究是LRSAM1蛋白的哪一部分结构调控了此种活性的下降,我们进一步构建了单个结构域突变体和多个结构域串联突变体,并用它们与含有RING结构域的活性突变体LRSAM1蛋白进行体外泛素化重组实验,其结果表明SAM或者CC2-SAM结构域的加入能显著减弱各种LRSAM1突变体的E3活性,乃至对野生型的LRSAM1蛋白也有明显的活性抑制作用。所以我们确定单独的CC2-SAM结构有抑制LRSAM1 E3活性的作用。考虑到LRSAM1ΔRING对野生型和LRSAM1ΔLRR没有抑制作用,说明有某种结构能够拮抗CC2-SAM调控的抑制作用。通过串联突变体与LRSAM1的体外重组实验,我们发现与CC2-SAM串联的CC1结构域能显著拮抗掉此种抑制作用,而不是单独加入的CC1结构域。最后我们在哺乳细胞中过表达底物蛋白TSG101和LRSAM1相关蛋白,研究LRSAM1对于底物的泛素化是否也受到相同的调控,得到了与体外一致的结论。综上所述,我们通过原核表达系统得到高质量的LRSAM1抗原蛋白,并对其多克隆抗体进行了制备,表明其拥有较好的特异性,并用于后续活性调控研究。虽然拥有LRR结构域的E3蛋白有一部分因其LRR的存在而自抑制,我们的结果表明,LRR结构域在LRSAM1 E3活性调控中没有自抑制作用。并且C端的RINGfinger结构域与其N端的结构域串联可以增大其E3活性的功能。LRSAM1分子间通过自缔结形成寡聚,这促使了分子间泛素分子的转移,即LRSAM1蛋白能与自身其它分子相互识别并促使分子间泛素化的发生。在研究这种分子间泛素化调控时,我们发现CC2-SAM结构域的额外加入能显著抑制LRSAM1 E3活性,并且只有与CC2-SAM串联的CC1能拮抗此种抑制,而单独加入的CC1结构域则没有此种作用。同时我们发现LRR结构域能通过分子间泛素分子的转移实现N端的单泛素化。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q75

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