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《西南大学》 2017年
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核酸探针电致化学发光生物传感器检测土壤中铅离子的研究

邓炜  
【摘要】:重金属离子具有生物毒性大、易被生物富集、难于自然降解等的特点,严重危害生态环境和人类生命健康,而传统检测方法多依赖大型仪器,存在检测时间长,灵敏度相对较低等缺点,因此探索建立快速、灵敏、低成本的痕量重金属分析检测方法有重要意义。电致化学发光(ECL)结合了发光分析的高灵敏度和电化学分析的高可控性,具有重现性好、灵敏度高和选择性好等优点,可显著提高分析检测灵敏度和选择性,尤其适用于被测物浓度低,组分复杂,干扰物多的环境样品。本论文以土壤中Pb~(2+)的检测为研究模型,利用具有高选择性的核酸探针为识别元件,从信号输出模式、ECL体系、核酸放大技术等多方面着手,并进一步结合多种复合纳米材料,设计构建了多种高灵敏ECL检测Pb~(2+)的新方法。研究结果为污染土壤Pb~(2+)的快速、灵敏的检测提供了一个新的思路和方法,有利于提高Pb~(2+)的检测精度,在土壤、水环境分析实践中具有十分重要的意义。主要研究结果如下:1.基于聚乙烯亚胺还原的金纳米颗粒固载核酸探针的“signal on”型ECL传感器的研究本实验结合目标物循环与杂交链式反应(HCR)信号放大策略构建了Pb~(2+)ECL生物传感器。该传感器可以通过Pb~(2+)和脱氧核酶(LC)的特异识别作用,并结合目标物循环和杂交链式(HCR)反应,在电极表面生成了大量由DNA杂交形成的长双链聚合物。这些双链聚合物可以通过静电吸附作用固载ECL信号分子邻菲罗啉钌配合物。利用固载在电极基底的聚乙烯亚胺还原的金纳米颗粒对发光试剂的共反应作用显著放大检测信号,构建了对Pb~(2+)的“signal on”响应模式ECL检测新方法。实验结果表明,在Pb~(2+)浓度范围为1×10-12 mol/L~1×10-7 mol/L(2.07×10-10 g/L~2.07×10-5 g/L)之间,表现出良好的线性关系,其检出限为3.33×10-13 mol/L(6.89×10-11 g/L)。将该方法用于土壤样品中铅离子的检测,所得回收率介于98.7%~103%之间,说明该传感器对pb~(2+)的检测良好的准确度。2.基于分子间和分子内共反应双重放大策略的“signalon”型ecl传感器的研究本实验首先制备了多边形的金纳米颗粒(hifaunps)作为固载基质,聚酰胺-胺型树枝状高分子pamam既作为交联分子又作为共反应基团,通过酰胺反应将发光试剂羧基化联吡啶钌ru-cooh与pamam交联到同一个分子内,制备了具有更高发光效率的自增强的ecl发光试剂作为ecl信标。另一方面,将l-半胱氨酸(l-cys)和金纳米颗粒电沉积到电极上,增大了电极的比表面积,用以固定大量端基为巯基的辅助探针(aps),同时l-cys与ru-cooh通过分子间共反应增强了ecl信号,从而实现了分子间和分子内共反应双重信号放大策略。当pb~(2+)存在时,pb~(2+)与固载到电极界面的捕获探针(cps)形成了稳定的g-四链体,诱导双链dna释放cps。电极上的aps进一步捕获信标产生ecl信号,pb~(2+)浓度越大,ecl响应越强。实验结果表明,该方法具有较好的选择性和稳定性,其线性范围为1.0×10-13mol/l~1.0×10-7mol/l(2.07×10-11g/l~2.07×10-5g/l),检出限为3.33×10-14mol/l(6.89×10-12g/l)。用ecl适体传感器和传统的石墨炉原子吸收光谱法(gf-aas)对相同的土壤样品进行检测,两种方法之间具有较好的一致性,证明该传感器在检测环境土壤中痕量的pb~(2+)很有应用潜力。3.基于金/石墨烯/c60纳米复合材料为固载基质的“signaloff”型ecl传感器的研究本实验制备了分子内自增强ecl分子pamam-ru作为发光物质直接标记对铅离子有特异识别作用的脱氧核酶8-17dnazyme的底物链。该分子通过分子内的相互作用及快速电子传递,极大地提高了ecl试剂的发光效率及稳定性。另一方面,制备了纳米金功能化的石墨烯和c60的复合物(au@rgo-c60),利用该纳米复合材料自身的大比表面积固载大量的8-17dnazyme使其与底物链结合形成pb~(2+)特异剪切位点,同时由于其自身具有促进电子传递作用进一步放大响应信号。当测试溶液中含有s2o82-作为分子间共反应试剂时,与pamam分子内自增强作用相结合实现双重信号放大,获得较强的初始信号。当pb~(2+)存在时,识别特异的剪切位点,从而使结合到电极表面的pamam-ru离开电极,ecl信号显著降低,构建了“signaloff”型ecl铅离子传感器。其检测范围为1.0×10-15mol/l~1.0×10-8mol/l(2.07×10-13g/l~2.07×10-6g/l),检测限为3.33×10-16mol/l(6.89×10-14g/l)。将制备的传感器用于实际土壤样品中pb~(2+)的检测,并采用标准加入法对传感器回收率进行了测定,所得回收率介于96.2%~103%之间,说明传感器具有较好的实际应用价值。4.基于碳量子点/石墨烯复合纳米材料为固载基质和金纳米颗粒为增强探针的“signal on-off”型ECL传感器的研究本实验以C60作为新型碳源,利用强酸氧化法加热回流合成法制得碳量子点(CQDs)为ECL发光试剂,并通过交联作用将CQDs固载到氨基功能化的石墨烯纳米材料表面。基于碱基的互补配对原则在电极表面引入标记了金纳米粒子的铅离子适体探针互补链(CDNA),以增强适体传感器的ECL响应,制得Pb~(2+)适体传感器。当有目标物Pb~(2+)存在时,Pb~(2+)与其适体链形成G四链体结构,释放出金纳米粒子标记的增强探针,从而使得ECL信号减小。该传感器的检测范围为1.0×10-13 mol/L~1.0×10-3 mol/L(2.07×10-11 g/L~2.07×10-1 g/L),检测限为3.3×10-11mol/L(6.89×10-12 g/L)。该ECL适体传感器对实际土壤样品中的Pb~(2+)进行检测,其回收率在98.8-105%。5.基于溶解氧/过硫酸根为ECL体系和卟啉铁/G-四链体为猝灭探针构建“signal on-off-on”型传感器的研究为了降低背景信号以增加灵敏度,本实验利用“signal on-off-on”型检测模式构建超灵敏ECL铅离子传感器。首先利用金纳米粒子的促进电子传递作用得到S2O82-的超高信号作为初始“signal-on”信号。接着利用线性滚环扩增反应得到一条与环形DNA模板互补的具有大量G碱基的酶链序列,使之与氯化血红素结合形成hemin/G-四链体结构,它的存在导致S2O82-电致化学发光猝灭,得到较低ECL信号的“signal-off”的状态。而当体系中出现Pb~(2+)时,Pb~(2+)剪切掉互补底物链探针,进而使hemin/G-四链体离开电极表面,从而引起ECL信号的恢复。因此“on-off-on”检测最终信号与目标物Pb~(2+)的浓度成正比,可以得到超灵敏的Pb~(2+)传感器。该传感器的线性响应范围为1×10-12~1×10-7mol/L(2.07×10-10 g/L~2.07×10-5 g/L),并且具有良好的再生性能。本文的主要创新点在于(1)提出了结合分子间和分子内共反应试剂放大响应信号的双重信号放大策略,为进一步提高电致化学发光分析土壤中Pb~(2+)的灵敏度和降低检测限提供了有益的尝试。(2)首次利用hemin与Pb~(2+)与Pb~(2+)适体探针四链体结构的竞争结合作用,构建了“signal-on-off-on”型信号响应模式实现了对土壤中Pb~(2+)的电致化学发光分析检测,该方法可简便、高效的降低背景信号,使得在提高灵敏度的同时也增强了检测的特异性。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:X833;S151.93

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