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《西南大学》 2017年
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家蚕过剩半月纹退化腹肢突变(E~(dl))的精细定位及相关调控元件鉴定

王红磊  
【摘要】:昆虫为了生存和繁衍演化出多样性的附肢,从发育生物学角度来看主要是进化过程中基因差异表达和功能变化的结果。附肢的发育是一个复杂的生理过程,由多层次的基因网络级联调控形成。同源异型基因(Homeotic gene,Hox)是首先在果蝇中发现的,是昆虫躯体模式发育的主要调控基因;Hox基因在基因组上成簇排列,按其在基因组上排列的顺序从3’到5’依次表达,分别决定躯体从前到后不同体节的特征,特别是附肢发育部位和形态等特征,对研究附肢发育和分化有重要的意义。在昆虫中对Hox基因功能的研究已经有一定基础,研究发现由于不同物种中Hox基因功能在进化上差异分化生成各式各样的附肢。Hox基因的表达受到精确的调控,在果蝇BX-C基因簇中已鉴定分析发现大量的顺式调控元件和非编码RNA(Non-coding RNA,nc RNA)调控Hox基因的精确表达;而在其他昆虫中Hox基因的表达调控研究,特别是Hox基因簇中功能元件对Hox基因调控的研究仍然匮乏。家蚕是重要的经济昆虫,拥有完整的基因组数据和精细的遗传变异图谱,也是鳞翅目基础生物学研究的重要模式。家蚕保存有大量Hox基因座位的突变,如E拟复等位基因群(E群),是研究鳞翅目Hox基因功能和表达调控的良好材料。家蚕E群位点有3个Hox基因,涉及30多个突变体,本研究选取E群过剩半月纹退化腹肢突变(extra-crescents and degenerated abdominal legs mutant,E~(dl))作为研究材料,通过定位克隆、表达分析及免疫组化等手段探究Hox基因对E~(dl)突变形成的作用机制;并且利用生物信息学、表达关联分析及RNAi等方法对定位区间存在的功能元件进行鉴定和功能研究,分析功能元件与Hox基因之间可能的作用关系。本论文所得主要结果如下:1.家蚕E~(dl)突变的形态特征观察和遗传分析家蚕E~(dl)突变位于家蚕第6连锁群21.1位点,是E群突变之一,其经典表型特征描述为:幼虫第3腹节背面有过剩半月纹,无星纹,第1腹足退化,显性突变。观察其表型特征为:幼虫第3腹节背面有一对过剩半月纹,第5腹节有星纹,同时腹面的第一对腹足退化,腹足远端的爪钩缺失,此外个别个体背部2、3腹节半月纹处出现环节愈合现象。遗传分析显示大造(正常型)与E~(dl)杂交得F1为正常型,F1自交产生的F2会分离出正常型和E~(dl)突变表型,且分离比为3:1;F1个体与正常型正反测交得到的后代均为正常型,F1个体与E~(dl)正反测交,得到的后代E~(dl)突变性状和正常型分离比1:1。通过杂交和回交实验发现E~(dl)突变为隐性突变,利用家蚕雌完全连锁的特性,对大造和E~(dl)突变进行杂交,再和E~(dl)突变测交,配制连锁定位群体。根据家蚕E群ECs-l和EKp-1突变的定位区域直接设计marker,利用386个BC1M个体对E~(dl)突变进行定位,E~(dl)突变位点被定位在marker SD02和SD04之间,与marker SD03紧密连锁,区间包含Bmabd-A。我们发现E~(dl)突变是E群变中目前发现的唯一隐性突变。2.E~(dl)突变的精细定位和分子解析扩大群体到1205个BC1M个体并加密标记,对E~(dl)突变进行精细定位。E~(dl)突变位点被定位到marker D4和D6之间约211 Kb的区域,此区域为Hox基因Bmabd-A和Bmabd-B之间的一段无预测基因的间区,分别位于Bmabd-A上游,Bmabd-B下游,距Bmabd-A约10 Kb,Bmabd-B约100 Kb。E~(dl)突变第三腹节腹足退化,在该环节主要表达的是Bmabd-A基因,且是家蚕腹足发育的必须基因,因此我们在家蚕胚胎腹足发育的关键时期戊3期(胚胎发育第20个阶段)调查Bmabd-A的表达,结果表明在该时期对腹足发育有重要作用的Bmabd-A表达水平降低。Hox基因簇中相邻基因间能相互调控,且基因组上排列靠后的Hox基因能抑制靠前基因的表达。我们调查Bmabd-A邻近Hox基因的表达发现,在基因组上分别位于Bmabd-A前后的Bm Ubx和Bmabd-B表达都明显升高。同时我们通过免疫荧光技术,调查了腹足远端发育基因Bm Dll的表达情况,在大造和E~(dl)突变正常发育附肢原基顶端都能检测到Bm Dll的表达,而在E~(dl)突变退化的腹足原基处Bm Dll的表达缺失,这与E~(dl)突变缺失腹足远端的表型相符。我们推测在E~(dl)突变中Bmabd-A的表达降低,继而改变腹足远端基因Bm Dll的表达,使突变中出现退化腹足的表型。3.E~(dl)突变定位区间mi RNA和顺式调控元件分析家蚕E位点与果蝇BX-C区域的序列同源,在果蝇同源的区域中有大量的顺式调控元件和mi RNA对邻近的Hox基因有调控作用。本部分我们分析了E~(dl)定位区间mi RNA胚胎期的表达模式及其与Hox基因表达的相关性;预测和鉴定E~(dl)定位区间的CTCF转录因子结合元件,并对其在家蚕中保守性和在E~(dl)突变及多品系中差异性进行分析。E~(dl)定位区间中有mi R-iab-4和mi R-2835两个mi RNA位点,其中mi R-iab-4位点能形成mi R-iab-4-3p,mi R-iab-4-5p和mi R-iab-8三个mi RNA。首先通过克隆分析发现两个mi RNA基因组上的pre-mi RNA序列在E~(dl)和野生型中没有任何差异。然后我们利用不同的软件预测mi RNA在Bm Ubx和Bmabd-A m RNA序列上的靶位点。RNAhybrid软件预测发现mi R-iab-4-3p在Bm Ubx和Bmabd-A序列上分别有4和5个靶位点;mi R-iab-4-5p在Bm Ubx序列上有4个靶位点而在Bmabd-A序列上没有靶位点;mi R-iab-8在Bm Ubx和Bmabd-A序列上都只有1个靶位点;mi R-2835在Bm Ubx和Bmabd-A序列上分别有4和1个靶位点。利用mi Rnada软件预测发现所有的mi RNA在Bm Ubx上都没有作用位点,而mi R-iab-4-3p,mi R-iab-8和mi R-2835在Bmabd-A上分别有1,2,1个靶位点。利用PITA软件预测发现只有mi R-iab-8在Bm Ubx上有1个靶位点,其他mi RNA在Bm Ubx上没有靶位点;mi R-iab-4-3p,mi R-iab-4-5p,mi R-iab-8和mi R-2835在Bmabd-A上分别有2,1,4,3个靶位点。值得注意的是,mi Rnada和PITA软件预测的mi R-iab-8和mi R-2835在Bmabd-A序列上有部分重叠的靶位点,而没有发现有三个软件共同预测的靶位点。由于家蚕腹足在胚胎期就已经形成,我们对mi R-iab-4-3p,mi R-iab-4-5p,mi R-2835,Bm Ubx和Bmabd-A在大造胚胎期的表达模式进行检测,并计算这三个mi RNA和Bm Ubx,Bmabd-A表达之间的相关性,结果发现Bm Ubx和Bmabd-A的表达与这三个mi RNA的表达没有相关性。CTCF转录因子结合位点是Hox基因簇中重要的顺式调控元件,对Hox基因的精确时空表达有重要调节作用。对E~(dl)突变定位区间的CTCF转录因子结合位点进行鉴定分析,发现共有8个CTCF转录因子结合位点。琼脂糖凝胶检测发现只有2位点的序列有多态性,多品系分析发现多态性并不特异。对结合位点及其前后各50bp的序列在家蚕和野蚕多品系中进行保守性分析,发现2、6、7、8位点序列保守,其他位点不保守。对E~(dl)定位区间CTCF结合位点序列比对分析发现,在E~(dl)突变中只有1和3位点与Dazao有差异,且多品系比对发现是非E~(dl)品系特异性差异。多品系分析发现2、6、7、8位点最保守,在所有的品系中都没有差异;1、5位点序列中有少量非品系特异差异;3、4位点有品系特异的差异。对定位区间不保守的1、3、4、5位点的变异序列进行分析,发现只有4位点第13个位置的序列由G变为A会导致4位点失去活性,其他变异并不影响位点的CTCF蛋白结合活性;4位点和5位点在邻近基因组位点,且4位点和5位点序列在检测的品系中不同时发生变异,保持该基因组区域CTCF蛋白结合调控的能力。综上E~(dl)突变定位区间除了结合位点4的所有CTCF结合位点与CTCF蛋白结合能力都是保守的,所有结合位点所在的基因组位点与CTCF蛋白结合能力均保守。4.E~(dl)突变定位区间lnc RNA分析我们在Bmabd-A和Bmabd-B基因间区发现一个新转录本,通过Race技术获得全长,ORF预测和分析发现其ORF小于300个碱基且无保守的结构域,鉴定为一个长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA),并命名为lnc RNA-iab1。lnc RNA-iab1具有多种剪接体,根据剪接体3’端在基因组上不同的位置可以分为两类type1和type2。利用Lnc Tar软件预测lnc RNA-iab1与Bm Ubx、Bmabd-A和Bmabd-B可能的相互作用,发现lnc RNA-iab1的各类剪接体都不能直接与Bm Ubx、Bmabd-A和Bmabd-B相互作用。利用RNAhybrid、mi Rnada和PITA三个不同的软件对mi RNA在lnc RNA-iab1转录本上的作用位点进行预测,mi Rnada软件预测发现只有mi R-iab-4-5p和mi R-iab-4-3p在lnc RNA-iab1转录本type2剪接体上分别有1个作用位点;RNAhybrid软件预测发现mi R-iab-4-5p、mi R-iab-4-3p和mi R-2835在lnc RNA-iab1转录本上分别有1、1、2个作用位点,mi R-iab-8在lnc RNA-iab1转录本上没有作用位点,且除了mi R-2835有一个位点只在type2剪接体存在,其他所有位点在各类剪接体都存在;PITA软件预测发现mi R-iab-4-3p和mi R-iab-8在lnc RNA-iab1转录本type2剪接体上分别有2个作用位点。综上我们发现mi RNA与lnc RNA-iab1可能有相互作用。通过胚胎期表达谱分析发现lnc RNA-iab1与其内含子区域的3个mi RNA基因mi R-iab-4-3p,mi R-iab-4-5p和mi R-2835的表达没有相关性;lnc RNA-iab1与Bmabd-A和Bmabd-B的表达模式在胚胎期和幼虫期存在很强的相关性,在变态发育期它们表达模式之间的相关性降低;lnc RNA-iab1与Bm Ubx的表达模式只在胚胎期有很强的相关性。4龄将眠组织表达分析发现,lnc RNA-iab1在神经和表皮中有特异性高表达,其中表皮中表达最高;对表皮进行分段检测发现,lnc RNA-iab1沿体轴从前往后表达量逐渐升高,第7-10腹节表达最高。为了探讨lnc RNA-iab1的功能,在4龄2天对lnc RNA-iab1进行RNAi处理,结果发现干涉个体大量致死(死亡个体和总注射个体的比例13/14,12/12),而干涉对照个体基本无影响(死亡个体和总注射个体的比例1/12),进一步通过分子检测发现lnc RNA-iab1干涉个体中lnc RNA-iab1的表达显著降低。调查干涉组中相关Hox基因Bmabd-A和Bmabd-B的表达,结果显示并无显著性变化。我们推测lnc RNA-iab1与Hox基因的表达相关性可能与lnc RNA-iab1的生产过程相关,即其成熟的转录本不影响Hox基因的表达水平;其转录本可能参与其他生理上的功能,对家蚕的存活有重要的影响。在E~(dl)突变中只检测到lnc RNA-iab1的type2类剪接体,type2部分剪接体的3’末端与Dazao比有差异,且缺少了type2类剪接体中与Bmabd-A重叠的剪切形式。在Dazao和E~(dl)突变腹足发育关键时期(戊3期)lnc RNA-iab1的总转录水平没有差异;而E~(dl)突变中lnc RNA-iab1只有type2类剪接体,比较Dazao和E~(dl)突变中type2类剪接体表达水平,即Dazao中type2类剪接体和E~(dl)突变中总转录水平发现,E~(dl)突变中type2类剪接体转录水平显著比Dazao中要高。lnc RNA-iab1中type2类剪接体转录覆盖的基因组区域远远大于type1类剪接体转录覆盖的基因组区域,会影响更多的基因组功能元件包括两个mi RNA位点,对相关Hox基因表达的影响更大。只有lnc RNA-iab1 type1类剪接体的3’末端在E~(dl)突变位点内,我们推测可能是定位区间相关功能元件的改变使type1类剪接体末端不能正常加尾,而只产生type2类剪接体,这可能与E~(dl)突变形成相关。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78;S881.2

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