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《西南大学》 2017年
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基于谷胱甘肽制备的银纳米簇和Maillard反应荧光产物构建光学传感器的研究

董江雪  
【摘要】:谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是一种含有活性巯基和g-酰胺键的小分子肽,其广泛存在于生物体内,可直接或间接参与生理活动。由于GSH具有较强的还原性,可以起到抗氧化作用,因此,GSH可在生物体内保护细胞和神经等不受氧自由基的损害。此外,GSH含有氨基、羧基、巯基和酰胺基等配位基团,因此,GSH是很多金属离子的螯合剂。GSH上的活性巯基可与重金属离子作用,尤其可与金/银发生强烈的相互作用,因此,GSH可作为模板制备金/银纳米簇。本论文首先基于GSH对银离子的螯合特性,以柠檬酸盐包裹的银纳米颗粒为前体,以GSH为刻蚀剂制备了发射强烈蓝色荧光的银纳米簇。此外,GSH是一种典型的氨基化合物,可代替氨基酸与羰基化合物发生Maillard反应,本论文进一步以GSH和抗坏血酸为底物,制备了Maillard反应荧光产物。与此同时,结合分子荧光和紫外-可见吸收光谱技术,本论文对基于GSH制备的银纳米簇和Maillard反应荧光产物在水溶液中的光学特性进行了研究,并以其为探针构建了检测生物分子和环境污染物的光学传感器。1.谷胱甘肽刻蚀法制备银纳米簇本章中,首先以柠檬酸盐为稳定剂,以硼氢化钠为还原剂制备了大尺寸的银纳米颗粒,进一步以谷胱甘肽为刻蚀剂对银纳米颗粒进行刻蚀,在水溶液中制备了稳定的、发射蓝色荧光的银纳米簇,其平均粒径约为1.93 nm,在水溶液中的荧光量子产率约为1.8%。实验考察了制备过程中各反应物的用量对银纳米簇的影响,以期得到光学性能更好的银纳米簇。同时,实验利用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱以及高分辨的透射电子显微镜对银纳米颗粒向银纳米簇的转换过程进行了监测,基于傅里叶变换红外光谱、能量色散X射线光谱、元素分析等技术对制备的荧光银纳米簇进行了表征。2.基于银纳米簇可逆的p H响应性质构建尿素和葡萄糖的光学传感器本章实验发现增加或降低溶液的p H可以引起银纳米簇在溶液中可逆的聚集和分散,从而导致溶液的荧光强度和吸光度可逆性的降低和恢复。银纳米簇表现出的p H诱导的可逆行为可归因于其表面配基(谷胱甘肽)和柠檬酸盐含有的大量氨基和羧基基团,这些功能基团使得银纳米簇之间极易形成弱的分子间相互作用力(如氢键作用等),并使其在溶液中保持平衡。然而,改变溶液的p H会打破银纳米簇原有的平衡状态,从而导致银纳米簇可逆的聚集和溶液光谱信号的可逆变化。此外,由于尿素和葡萄糖可以通过酶催化反应分别产生NH3和葡萄糖酸,从而改变溶液的p H值。本章基于此原理,进一步以谷胱甘肽刻蚀法制备的银纳米簇为光学探针,构建了可再生的尿素和葡萄糖生物传感器。该传感器灵敏度高、选择性好,已将其用于实际样品分析,实现了人血清和尿液中尿素和葡萄糖的检测。3.以银纳米簇为探针结合顶空-单液滴微萃取技术构建高灵敏、高选择性的溶解氨的光学传感器本章以谷胱甘肽刻蚀法制备的银纳米簇为探针,基于荧光和紫外-可见吸收光谱、顶空-单液滴微萃取技术,构建了一个简单的溶解氨传感平台。其传感机理为氨的挥发性和碱性及探针对溶液p H变化的敏感响应,在碱性溶液中银纳米簇极易聚集从而导致溶液的荧光猝灭和吸光度降低。此外,该传感器具有较高的选择性和灵敏度,大部分无机离子和氨基酸均不干扰水溶液中氨的检测,传感器的线性响应范围为10–350μM,检出限为336 n M。同时,已将该传感器用于实际水样中溶解氨的检测,结果令人满意。4.谷胱甘肽和抗坏血酸的Maillard反应荧光产物的制备及其快速检测Hg~(2+)和生物巯基的应用研究Maillard反应及其荧光产物已经引起食品和生命科学领域工作者的大量关注。然而,从该反应中单独分离出荧光产物并将其作为探针用于传感器领域,以检测某一特定物质的研究至今尚未见报道。本章中,我们以谷胱甘肽和抗坏血酸为底物进行Maillard反应,并从其产物中分离出水溶性的荧光探针,该探针具有非常好的稳定性和较高的荧光量子产率(18.2%)。实验进一步探究了上述Maillard反应荧光产物(MRFPs)在传感器领域的应用,在酸性条件下(p H4.1),将其作为探针用于快速、免标记地检测Hg~(2+)和生物巯基(半胱氨酸、高半胱甘酸和谷胱甘肽)。检测机理主要是基于Hg~(2+)可以猝灭MRFPs的荧光,而生物巯基可以通过竞争反应优先与Hg~(2+)作用,从而使反应溶液的荧光恢复。该传感体系具有较高的选择性和灵敏度,检测Hg~(2+)、半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的线性响应范围分别为0.05–12、0.5–10、0.3–20和0.3–20μM,检出限依次为22、47、96和30 n M(3s)。此外,该传感体系已成功应用于实际水样中的Hg~(2+)和人血浆样品中生物巯基的检测。5.以谷胱甘肽和抗坏血酸的Maillard反应荧光产物为成像探针检测活细胞内的Fe~(3+)发展生物相容性好且可用于细胞内物质检测的成像探针在生物医药和生命科学领域有着重大意义。本章中,实验以谷胱甘肽和抗坏血酸的MRFPs为成像探针,构建了活细胞内选择性检测Fe~(3+)的生物传感器。实验表明,该MRFPs是一种无生物毒性,且具有非常好的生物相容性的荧光材料。在体外模拟的生理p H(p H 7.0)下,与其他金属离子相比,MRFPs对Fe~(3+)显示出较好的特异性响应,当Fe~(3+)浓度为0.05–50 m M时,反应溶液的荧光强度随Fe~(3+)浓度的增加呈线性降低。此外,实验条件下,我们对MRFPs与Fe~(3+)之间的相互作用机理进行了讨论,该实验现象可归因于激发态的MRFPs分子向金属离子的电子转移。进一步实验表明,MRFPs可作为成像探针对活细胞内的Fe~(3+)进行特异性检测。
【关键词】:银纳米簇 Maillard反应产物 荧光 比色法 传感器
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TQ422;TP212
【目录】:
  • 缩写符号对照表7-8
  • 摘要8-11
  • ABSTRACT11-15
  • 第一章 绪论15-41
  • 1.1 谷胱甘肽概述15-16
  • 1.1.1 谷胱甘肽的结构15
  • 1.1.2 谷胱甘肽的生理功能和性质15-16
  • 1.2 金属纳米簇概述16-17
  • 1.3 银纳米簇的制备方法17-26
  • 1.3.1 以聚合物为模板制备银纳米簇18-20
  • 1.3.2 以DNA为模板制备银纳米簇20-22
  • 1.3.3 以蛋白质为模板制备银纳米簇22-25
  • 1.3.4 以小分子为模板合成银纳米簇25-26
  • 1.4 银纳米簇的相关应用研究26-32
  • 1.4.1 银纳米簇为探针的离子传感器26-29
  • 1.4.2 银纳米簇为探针的分子传感器29-32
  • 1.4.3 银纳米簇作为生物成像探针的应用研究32
  • 1.5 Maillard反应概述32-34
  • 1.5.1 Maillard反应历程32-33
  • 1.5.2 Maillard反应的影响因素33-34
  • 1.6 Maillard反应产物的性质和应用34-36
  • 1.6.1 Maillard反应产物的风味35
  • 1.6.2 Maillard反应产物的颜色35
  • 1.6.3 Maillard反应产物的抗氧化性35-36
  • 1.7 Maillard反应荧光产物概述36-38
  • 1.8 本文的主要研究内容及意义38-41
  • 1.8.1 本文的主要研究内容38-39
  • 1.8.2 本文的主要研究意义39-41
  • 第二章 谷胱甘肽刻蚀法制备银纳米簇41-53
  • 2.1 引言41-42
  • 2.2 实验部分42-43
  • 2.2.1 仪器42
  • 2.2.2 试剂42
  • 2.2.3 实验方法42-43
  • 2.3 结果与讨论43-51
  • 2.3.1 银纳米簇的制备方法43-44
  • 2.3.2 反应物的用量对制备银纳米簇的影响44-45
  • 2.3.3 光谱和电镜法监测制备银纳米簇的刻蚀过程45-48
  • 2.3.4 银纳米簇的相关表征48-50
  • 2.3.5 银纳米簇荧光量子产率的计算50
  • 2.3.6 银纳米簇的稳定性实验50-51
  • 2.4 结论51-53
  • 第三章 基于银纳米簇可逆的pH响应性质构建尿素和葡萄糖的光学传感器53-71
  • 3.1 引言53-54
  • 3.2 实验部分54-55
  • 3.2.1 仪器54
  • 3.2.2 试剂54
  • 3.2.3 银纳米簇的制备54
  • 3.2.4 银纳米簇的pH响应实验54-55
  • 3.2.5 尿素和葡萄糖的检测55
  • 3.3 结果与讨论55-69
  • 3.3.1 银纳米簇的pH响应行为55-57
  • 3.3.2 银纳米簇的pH响应机理探究57-62
  • 3.3.3 构建尿素和葡萄糖传感器62-63
  • 3.3.4 传感器的影响因素63-65
  • 3.3.5 选择性和灵敏度65-67
  • 3.3.6 传感器的可再生性67-68
  • 3.3.7 实际样品分析68-69
  • 3.4 结论69-71
  • 第四章 以银纳米簇为探针结合顶空-单液滴微萃取技术构建高灵敏、高选择性的溶解氨的光学传感器71-85
  • 4.1 引言71-72
  • 4.2 实验部分72-73
  • 4.2.1 仪器72
  • 4.2.2 试剂72
  • 4.2.3 银纳米簇的制备72
  • 4.2.4 检测水溶液中的溶解氨72-73
  • 4.2.5 本方法与纳氏试剂比色法的检测性能比较73
  • 4.3 结果与讨论73-84
  • 4.3.1 以银纳米簇为探针构建溶解氨的传感器73-76
  • 4.3.2 传感器的灵敏度76-80
  • 4.3.3 传感器的选择性80-82
  • 4.3.4 传感器的可行性和实用性82-84
  • 4.4 结论84-85
  • 第五章 谷胱甘肽和抗坏血酸的Maillard反应荧光产物的制备及其快速检测Hg~(2+)和生物巯基的应用研究85-103
  • 5.1 引言85-86
  • 5.2 实验部分86-88
  • 5.2.1 仪器86
  • 5.2.2 试剂86
  • 5.2.3 制备谷胱甘肽和抗坏血酸的Maillard反应荧光产物86-87
  • 5.2.4 检测Hg~(2+)和生物巯基87-88
  • 5.2.5 实际样品分析88
  • 5.3 结果及讨论88-101
  • 5.3.1 Maillard反应荧光产物的制备和表征88-92
  • 5.3.2 Maillard反应荧光产物的稳定性实验92-94
  • 5.3.3 以Maillard反应荧光产物为探针检测Hg~(2+)和生物巯基94-101
  • 5.3.4 实际样品中检测Hg~(2+)和生物巯基101
  • 5.4 结论101-103
  • 第六章 以谷胱甘肽和抗坏血酸的Maillard反应荧光产物为成像探针检测活细胞内的Fe3+103-115
  • 6.1 引言103-104
  • 6.2 实验部分104-106
  • 6.2.1 仪器104-105
  • 6.2.2 试剂105
  • 6.2.3 Maillard反应荧光产物的制备105
  • 6.2.4 细胞外检测Fe~(3+)105
  • 6.2.5 细胞毒性实验105
  • 6.2.6 活细胞内的Fe~(3+)成像分析105-106
  • 6.3 结果及讨论106-114
  • 6.3.1 Maillard反应荧光产物的细胞毒性106-107
  • 6.3.2 细胞外检测Fe~(3+)107-110
  • 6.3.3 检测Fe~(3+)的机理探究110-112
  • 6.3.4 细胞内检测Fe~(3+)112-114
  • 6.4 结论114-115
  • 全文总结115-117
  • 参考文献117-143
  • 致谢143-145
  • 攻读博士学位期间的研究成果145-146

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