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《西南大学》 2017年
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基于蛋白组学的甘蓝自交不亲和性相关新基因的克隆与功能探索

曾静  
【摘要】:显花植物的有性生殖过程是一个包括从花粉接触柱头到受精完成的连续的复杂的过程,能否成功授粉是其中至关重要的一步。大多数雌雄同体植物进化出自交不亲和系统(Self-incompatibility,SI)来阻止自交、促进杂交、保持物种多样性。根据遗传机制的不同,自交不亲和分为孢子体型自交不亲和(Sporophytic self-incompatibility,SSI)与配子体型自交不亲和(Gametophytic self-incompatibilty,GSI)。芸薹属甘蓝由单一S位点基因控制自交不亲和反应,是典型的孢子体型自交不亲和植物,其自交不亲和信号传导途径是研究植物细胞间信号传导的模式系统。蛋白质是生命活动的直接体现者,随着人类和各种生物基因组测序的完成,生物研究进入到后基因组时代,其中蛋白质组学是后基因组时代研究的重要手段之一。蛋白质双向电泳(Two dimensional Electrophoresis,2-DE)技术由于能够同时在一张胶上分离几千甚至上万个蛋白质点,成为了蛋白质组学研究的主要支撑技术之一,质谱技术的发展又使其更广泛的应用于蛋白质组学研究。酵母双杂交技术、pull-down等方法也为在体内、体外研究蛋白质相互作用提供了简单、高效、快捷的途径。本文利用蛋白质双向电泳技术分离、鉴定SI甘蓝自花、异花授粉不同时间点柱头差异表达蛋白质。筛选出自花授粉特异表达和异花授粉上调表达蛋白质,分析它们在花器官、叶片等组织和授粉过程中m RNA表达量变化。利用pull-down和质谱技术分离、鉴定了甘蓝柱头与SI相关新基因CML27相互作用的蛋白质;研究了SI相关基因SRBP1 RNA结合力;利用酵母双杂交技术检测了SI新因子Bo ROH1与Bo Exo70A1之间的相互作用,主要的工作与结果如下:甘蓝柱头差异表达蛋白质的分离与鉴定(1)SI甘蓝柱头差异表达蛋白质的分离与鉴定通过形态学观察和亲和指数测定两种方法鉴定了SI甘蓝A4自交不亲和性和与F1杂交亲和性。优化了双向电泳过程中IPG胶条、上样量以及等电聚焦程序等条件,获得了分辨率高、重复性好的蛋白质双向电泳(2-DE)图像。利用PDQuest软件分析自花授粉0 min、1 h、2 h和异花授粉1 h柱头总蛋白质2-DE图像,发现自花授粉过程中,柱头总蛋白质主要在1 h时发生变化。自花授粉0min和1 h 2-DE图像中发现了26个差异表达蛋白质点,其中6个特异表达,16个上调表达,4个下调表达;自花、异花授粉1 h 2-DE图像中发现了26个差异表达蛋白质点,其中3个特异表达,6个在自花授粉柱头中上调表达,17个下调表达。自花授粉和异花授粉柱头2-DE图像中成功鉴定了44个差异表达蛋白质点。KEGG和GO注释归类到:防御与胁迫反应(15,34%)、蛋白质代谢(7,16%)、碳水化合物与能量代谢(6,14%)、翻译调控(5,11%)、花粉管发育(4,9%)、囊泡运输(4,9%)、细胞骨架蛋白质(2,4.5%)和未知功能蛋白质(1,2.5%)等8个生物学过程。SI甘蓝自花授粉0 min vs 30 min和0 min vs 60 min转录组中分别发现了2870和3029个差异表达基因。GO和KEGG数据库在0 min vs 30 min组中分别注释了2738和815个基因,占总差异表达基因的95%和28%;0 min vs 60 min组中分别注释了2904和961个差异表达基因,占总差异表达基因的96%和32%。综合蛋白质组和转录组数据认为差异表达基因、蛋白质CML27、SRBP1和ROH1是SI相关基因。(2)差异表达蛋白质基因的克隆与表达分析分析了自花授粉柱头特异表达蛋白质C2H2、VPS29和annexin2以及异花授粉柱头上调表达蛋白质CML27、myosin、tubulin和BPS1在花器官与自花、异花授粉过程中m RNA表达量。组织表达特异性分析发现,C2H2、VPS29、annexin2和tubulin在柱头中m RNA表达量高于花粉;myosin和BPS1在花粉和柱头中m RNA表达量相同;CML27在花粉中的m RNA表达量高于柱头。q RT-PCR分析发现自花、异花授粉过程中,C2H2和CML27 m RNA先上调再下调表达;myosin m RNA上调表达;Tubulin和BPS1先下调再上调表达;VPS29在自花授粉过程中先上调再下调表达,异花授粉过程中下调表达;Annexin2在自花授粉过程中下调表达,异花授粉过程中先下调再上调表达。(3)SI相关新基因CML27的表达和柱头相互作用蛋白质鉴定将大肠杆菌中诱导表达的CML27蛋白质与SI甘蓝自花授粉1 h柱头总蛋白质孵育后,电泳分离,在130-180 k Da处发现了一条特异性条带。利用质谱技术成功在该条带中发现了19种蛋白质,KEGG和GO注释归类到:防御与胁迫反应(2,10.5%)、翻译调控(5,26%)、基因沉默(2,10.5%)、蛋白质代谢(4,21%)、钙离子结合(2,10.5%)、染色体组织(2,10.5%)、囊泡运输(1,5.5%)和SI相关基因(1,5.5%)等8种生物学反应过程。在这些蛋白质中5种蛋白质与Ca2+相关(AGP31、EF-2、EF-1α、PLDα1和PLDα2)、1个蛋白质(coatomer subunit alpha-2-like)与囊泡运输相关和1个已知SI相关因子(SLG),说明CML27可能参与到自交不亲和反应中,作用于自花授粉柱头乳突细胞内Ca2+浓度的变化。(4)SI相关新基因SRBP1的基因克隆及功能研究氨基酸序列分析发现拟南芥中SRBP1与甘蓝SRBP1A/2A氨基酸序列相似性达到了98%。生物信息学分析发现SRBP1、SRBP1A/2A在N-端含有一个RNA识别域(RRM)、C-端含有一个富含甘氨酸序列(GRD)。转基因拟南芥GUS表达分析发现,在植株根尖、茎尖、侧根萌发点、叶片以及花器官中都观察到了较强的GUS信号,随着组织发育GUS信号变弱。SRBP1功能研究发现,原核表达SRBP1蛋白质与长链RNA结合,不与mi RNA结合;烟草表达SRBP1蛋白质特异性的与mi RNA166结合。这些结果表明SRBP1能与长链和mi RNA结合,蛋白质的翻译后修饰可能对于SRBP1与miRNA的结合力有决定性作用。(5)SI相关新基因ROH1与Exo70A1的表达与相互作用研究甘蓝中ROH1为单外显子编码基因,编码的蛋白质含有398个氨基酸残基。ROH1在甘蓝花药、柱头、幼茎、幼根及叶片中都有表达。自花授粉过程中,ROH1在柱头中表达量呈现出“上升-下降-上升”的变化趋势,1 h时表达量最高;Exo70A1在柱头中表达量呈现出先下降后上升的变化趋势,授粉1 h时表达量最高。通过酵母双杂交技术验证了ROH1和Exo70A1之间的相互作用。
【关键词】:自交不亲和 蛋白质质谱 转录组 差异表达分析 蛋白质相互作用 功能分析
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q943.2;S635
【目录】:
  • 摘要7-10
  • Abstract10-14
  • 第一章 文献综述14-28
  • 1.1 芸薹属植物自交不亲和性研究进展14-20
  • 1.1.1 SSI反应雌性决定因子14-15
  • 1.1.2 SSI反应雄性决定因子15-16
  • 1.1.3 S受体激酶下游信号传导元件及其争议16-19
  • 1.1.4 SSI级联反应过程19-20
  • 1.2 蛋白质组学技术研究进展20-22
  • 1.2.1 双向电泳技术研究进展21-22
  • 1.2.2 质谱技术在蛋白质鉴定中的应用22
  • 1.3 转录组学研究进展22-23
  • 1.4 蛋白质相互作用研究进展23-28
  • 1.4.1 酵母双杂交技术在蛋白质相互作用研究中的应用23-24
  • 1.4.2 pull-down体外检测蛋白质相互作用的应用24-25
  • 1.4.3 免疫共沉淀技术25-26
  • 1.4.4 双分子荧光互补技术26
  • 1.4.5 串联亲和纯化技术26-28
  • 第二章 引言28-32
  • 2.1 研究目的与意义28-29
  • 2.2 研究内容29-31
  • 2.3 技术路线31-32
  • 第三章 SI甘蓝柱头差异表达蛋白质的分离与鉴定32-74
  • 3.1 引言32
  • 3.2 材料32-33
  • 3.3 方法33-40
  • 3.3.1 SI甘蓝自交不亲和性鉴定33
  • 3.3.2 SI甘蓝柱头总蛋白质提取33-34
  • 3.3.3 SI甘蓝柱头蛋白质双向电泳体系优化34-35
  • 3.3.4 SI甘蓝自花、异花授粉柱头差异表达蛋白质分离35
  • 3.3.5 2-DE凝胶图像采集及分析35
  • 3.3.6 胶内酶解及MALDI-TOF-MS质谱鉴定35-36
  • 3.3.7 SI甘蓝自花授粉柱头转录组分析36-40
  • 3.4 结果分析40-63
  • 3.4.1 SI甘蓝自花、异花花粉萌发及花粉管观察40-43
  • 3.4.2 SI甘蓝自交不亲和性鉴定43-44
  • 3.4.3 SI甘蓝柱头蛋白质双向电泳体系优化结果44-47
  • 3.4.4 SI甘蓝自花、异花授粉柱头双向电泳图像初步分析结果47-52
  • 3.4.5 差异表达蛋白质MALDI-TOF-MS鉴定结果52-61
  • 3.4.6 蛋白质组与转录组相关性分析61-63
  • 3.5 讨论63-71
  • 3.5.1 SI甘蓝柱头蛋白质双向电泳体系优化64-65
  • 3.5.2 差异表达蛋白质GO注释及其与SI的关系65-70
  • 3.5.3 SI相关新基因的发现70-71
  • 3.6 小结71-74
  • 第四章 SI甘蓝柱头DEPs基因的克隆与表达分析74-88
  • 4.1 引言74
  • 4.2 材料74
  • 4.3 方法74-76
  • 4.3.1 RNA提取和cDNA合成74-75
  • 4.3.2 DEPs基因cDNA序列扩增75-76
  • 4.3.3 DEPs组织表达特异性分析76
  • 4.3.4 自花、异花授粉过程中DEPs表达分析76
  • 4.4 结果分析76-84
  • 4.4.1 DEPs cDNA序列扩增与分析76-81
  • 4.4.2 花器官和叶片中DEPs表达分析81-82
  • 4.4.3 自花、异花授粉过程中DEPs表达分析82-84
  • 4.5 讨论84-86
  • 4.5.1 自花授粉柱头特异表达蛋白质85-86
  • 4.5.2 异花授粉柱头上调表达蛋白质86
  • 4.6 小结86-88
  • 第五章 SI相关新基因CML27的表达和柱头相互作用蛋白质鉴定88-100
  • 5.1 引言88-89
  • 5.2 材料89
  • 5.3 方法89-92
  • 5.3.1 SI甘蓝柱头总蛋白质提取89
  • 5.3.2 CML27蛋白质表达及纯化89-91
  • 5.3.3 Western-blot91-92
  • 5.3.4 蛋白质质谱鉴定92
  • 5.4 结果分析92-97
  • 5.4.1 GST-CML27蛋白质表达与纯化92-93
  • 5.4.2 GST-CML27柱头相互作用蛋白质质谱鉴定结果93-97
  • 5.5 讨论97-98
  • 5.6 小结98-100
  • 第六章 SI相关新基因SRBP1的基因克隆及功能研究100-112
  • 6.1 引言100
  • 6.2 材料100-101
  • 6.3 方法101-104
  • 6.3.1 SRBP1表达与转基因载体构建101
  • 6.3.2 GUS转基因植株筛选及表达分析101-102
  • 6.3.3 原核表达SRBP1蛋白质的纯化102
  • 6.3.4 烟草中表达SRBP1蛋白质的纯化102-103
  • 6.3.5 SRBP1与RNA结合力分析103-104
  • 6.4 结果分析104-109
  • 6.4.1 SRBP1系统发育分析104
  • 6.4.2 GUS转基因植株表达分析104-105
  • 6.4.3 SRBP1原核诱导表达以及RNA结合力分析105-106
  • 6.4.4 烟草中表达SRBP1蛋白质的纯化106-108
  • 6.4.5 烟草中表达SRBP1与miRNA结合力分析108-109
  • 6.5 讨论109
  • 6.6 小结109-112
  • 第七章 SI相关新基因ROH1与Exo70A1的表达与相互作用研究112-122
  • 7.1 引言112
  • 7.2 材料112-113
  • 7.3 方法113-114
  • 7.3.1 ROH1和Exo70A1基因扩增113
  • 7.3.2 BoROH1和BoExo70A1表达分析113-114
  • 7.3.3 甘蓝授粉柱头电镜扫描观察114
  • 7.3.4 ROH1与Exo70A1相互作用鉴定114
  • 7.4 结果分析114-118
  • 7.4.1 甘蓝授粉柱头电镜扫描观察114-115
  • 7.4.2 ROH1和Exo70A1基因克隆及序列分析115-116
  • 7.4.3 BoROH1组织表达分析116
  • 7.4.4 酵母双杂交重组质粒自激活检测和毒性鉴定116-117
  • 7.4.5 Exo70A1与ROH1相互作用检测117-118
  • 7.5 讨论118-120
  • 7.6 小结120-122
  • 第八章 结论与展望122-126
  • 8.1 结论122-124
  • 8.1.1 SI甘蓝柱头差异表达蛋白质的分离与鉴定122
  • 8.1.2 SI甘蓝柱头DEPs基因的克隆与表达分析122-123
  • 8.1.3 SI相关新基因CML27的表达和柱头相互作用蛋白质鉴定123
  • 8.1.4 SI相关新基因SRBP1的基因克隆及功能研究123
  • 8.1.5 SI相关新基因ROH1与Exo70A1的表达与相互作用研究123
  • 8.1.6 三个新基因编码蛋白可能参与的SI信号转导途径123-124
  • 8.2 创新点124
  • 8.3 展望124-126
  • 参考文献126-146
  • 附录Ⅰ146-148
  • 发表论文及参加课题一览表148-150
  • 致谢150

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