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《西南大学》 2017年
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甘蓝型油菜转录因子NST3基因编辑和超表达载体构建

廖芳  
【摘要】:油菜是世界上分布最广的油料作物之一,也是我国第一大油料作物。在我国,菌核病和油菜倒伏是限制油菜产量最主要的因素。木质素的含量的多少跟作物的抗病性、抗倒伏能力有关。植物细胞木质化提高细胞壁的强度,不仅可以增强植物抗病性,也可以增强抗倒伏能力。油菜生长后期是倒伏易发生的时期,也是菌核病的高发期,两者变现为交互作用。前期研究发现在油菜茎秆中,S型木质素单体含量越高,植物抗倒伏能力越强,并且对菌核病的抗性也越强。本研究论文主要包括首先对甘蓝型油菜不同器官的NST3基因的四个成员进行表达分析,在线对四个成员进行基因结构分析,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,构建NSR3家族的CRISPR-Cas9基因编辑系统,构建BnaA09g24190D成员的超表达载体。成功构建载体后,将其转化甘蓝型油菜,并得到阳性的转基因苗。提取油菜转基因苗DNA,设计特异引物扩片段及测序。本实验的主要结果如下:1、油菜的NST3基因有四个成员,分别是BnaA05g17950D、BnaA09g24190D、BnaC05g24890D和BnaC05g28390D。四个成员中,BnaA09g24190D、BnaC05g24890D的表达量均高于其他两个成员,在根、茎、花蕾花、角果和种子中BnaA09g24190D的表达量均比BnaC05g24890D高,在根中,BnaA09g24190D的表达量几乎是BnaC05g24890D的5倍。在茎中,BnaA09g24190D的表达量几乎是BnaC05g24890D的2.5倍。四个成员中,BnaA05g17950D、BnaC05g28390D的表达量较低,在子叶、叶和花蕾均不表达,在其他部位的表达量也较低。通过基因的表达量分析,可以推测,在油菜的这四个成员中,BnaA09g24190D、BnaC05g24890D在调节油菜次生细胞壁合成和调控木质素单体组分起主要作用,尤其是BnaA09g24190D。2、对BnaA05g17950D、BnaA09g24190D、BnaC05g24890D和BnaC05g28390D在线进行基因结构分析。BnaA05g17950D全长1819bp,CDS长927bp,该基因有4个外显子,3个内含子;BnaA09g24190D全长1776bp,CDS长1095bp,该基因有3个外显子,2个内含子;BnaC05g24890D全长1832bp,CDS长1116bp,3个外显子,2个内含子;BnaC05g28390D全长为2146bp,CDS长978bp,5个外显子,4个内含子。对BnaA05g17950D、BnaA09g24190D、BnaC05g24890D和BnaC05g28390D编码的蛋白质进行分析,分别含308,364,371,325个氨基酸,分子量在35.75~42.99KD之间,等电点均小于7,二级结构中,α-螺旋占24.45%~29.54%,β-转角占8.36%~8.77%,随机卷曲占40.62%~48.35%,延伸链占17.25%~21.23%。它们都具有NAM典型特征的保守域,根据它们的保守域能够预测出三级结构。3、本实验共得到22株阳性转基因苗,在转基因苗中,不同的基因成员的编辑情况也各不相同。在22株基因阳性植物中,只有2株的BnaA05g17950D得到编辑,编辑的效率为9.09%。BnaA09g24190D在11株油菜中都得到编辑,编辑的效率为50%。BnaC05g24890D在8株转基因油菜中都得到编辑,编辑的效率为36.4%。BnaC05g28390D在4株转基因油菜中得到编辑,编辑的效率为18.2%。第3、22株油菜转基因苗四个基因同时被编辑,第1、7株的BnaA09g24190D、BnaC05g24890D同时被编辑,第9株的油菜转基因苗的BnaA09g24190D、BnaC05g24890D、BnaC05g28390D都被编辑,第12株转基因油菜的BnaC05g24890D、BnaC05g28390D同时被编辑,第17株的转基因油菜的BnaA09g24190D、BnaC05g24890D同时被编辑。CRISPR-Cas9编辑得到结果可分为三类:靶位点及其附近碱基缺失、插入、既有缺失又有插入。4、在四个成员中,BnaA09g24190D在调节油菜次生细胞壁合成和调控木质素单体组分起最主要作用,因而本实验构建了BnaA09g24190D的超量表达载体,并转化油菜。本实验的后续工作,CRISPR-Cas9编辑和超表达的转基因苗的木质素单体含量变化情况、对抗菌核病的抗感情况和抗倒伏情况需要实验室的相关人员跟进。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q943.2;S565.4

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