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《西南大学》 2017年
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水稻E3泛素连接酶编码基因DSG1的功能分析

娄启金  
【摘要】:株高和粒形是水稻最重要的农艺性状,其调控机理的研究一直被认为是将来提高水稻产量的重要手段。我们在EMS突变体库中筛选到了一个稳定遗传的突变体,该突变体同时影响株高和粒形的发育,其株高显著降低、籽粒明显变短,因此将其命名为水稻矮化短粒突变体dwarf and short grain 1(dsg1)。遗传分析确定dsg1突变性状是受一对隐性核基因控制。DSG1被定位在第3染色体70Kb范围内,该区间已有一个与dsg1表型类似的突变体报道。通过测序获得一个编码U-box结构域的候选基因,并参与水稻株高和粒型的调控。在本研究中,我们将通过表型鉴定、基因定位和候选基因验证等方法确定目的基因,最后通过表达模式分析、亚细胞定位、超表达分析、细胞学分析以及激素实验等分析DSG1控制水稻株高及粒形的相关机理,为进一步开展基因互作等研究奠定基础。具体结果如下:1、形态学及农艺性状分析:与野生型相比,在苗期,dsg1突变体的根长和幼苗高度显著减小,dsg1突变体叶鞘长度降低;在生殖生长阶段,dsg1突变体株高显著降低,且所有节间长度变短;dsg1突变体籽粒长度减小、结实率降低;dsg1突变体小穗长度减少,平均单位面积细胞数显著增加,小穗的平均细胞长度降低;dsg1突变体的剑叶、倒二和倒三叶宽度增加,且倒三叶长度缩短,dsg1突变体叶片的下部严重卷曲。2、遗传分析及基因定位:利用不育系西农1A与dsg1突变体杂交,所有F1植株显示正常表型,F2植物呈3:1(正常:矮化)的分离比,表明dsg1突变体表型由单个隐性核基因控制。通过基因定位,DSG1基因被定位在第3染色体上的标记SSR3-28和RM14645之间的190kb DNA区域;测序分析鉴定突变基因为LOC_Os03g13010。3、DSG1的候选基因验证:通过构建LOC_Os03g13010野生型DNA片段载体,转化dsg1突变体。阳性转基因植株的突变表型得到了完全的恢复。因此确定LOC_Os03g13010就是DSG1的目的基因。4、DSG1的表达模式分析:通过q RT-PCR和Pro DSG1::GUS在不同组织中检测到DSG1表达。DSG1在根、茎、叶片、叶鞘和小穗中表达较好。其中,DSG1在叶和小穗中的表达水平高于其它组织。5、亚细胞定位:将DSG1的编码序列融合至GFP的N末端,去掉终止密码子,并在35S启动子控制下的水稻原生质体中瞬时表达。DSG1蛋白主要定位于细胞核和细胞质中。6、超表达研究:通过构建超表达载体,并转化中花11。DSG1表达量在超表达植物中显著增加。与野生型相比,超表达植株在植物高度或籽粒长度方面均没有显著差异。7、细胞学分析:通过体式镜、石蜡切片,扫描电镜等分析,确定dsg1突变体中的突变表型是由于在不同组织中细胞分裂或细胞伸长缺陷造成的。同时DSG1还参与了叶片侧向发育。8、激素途径分析:dsg1突变体表现出典型的油菜素内酯(BR)缺失表型,矮化和紧凑的株形,宽和直立的叶子,并且分蘖减少。叶夹角倾斜实验表明DSG1参与BR反应,属于BR不敏感突变体。同时BR途径相关基因,Os D1、Os GSK1、Os MADS55和BZR1在dsg1成熟叶片中比在野生型中表达量下调。此外,通过q RTPCR分析DSG1在用各种外源激素(包括BR、GA、IAA、ETH、SA和ABA)处理植株中的表达量变化情况。结果表明,DSG1被BR、ETH、IAA和SA抑制。这些结果说明DSG1参与了多种激素途径。9、E3泛素连接酶活性测定:DSG1编码U-box结构域,E3连接酶活性相关蛋白结构域。为了检查dsg1是否与E3连接酶活性缺失有关,我们测量了野生型和dsg1突变体植株在幼苗和前期阶段的E3连接酶活性。dsg1的E3连接酶活性均显著低于野生型叶,这表明E3连接酶活性降低与dsg1突变体表型相关。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S511

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