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《西南大学》 2018年
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StAR在尼罗罗非鱼性腺分化和配子发生过程中的功能研究

蔡静  
【摘要】:在脊椎动物中,类固醇激素的合成由一系列类固醇合成酶共同参与调控。类固醇激素合成首先需要将初始底物胆固醇从细胞质基质转运到线粒体内膜,然后在类固醇合成酶的催化作用下合成各种激素。研究表明,底物的运输需要类固醇合成急性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein,StAR)的参与。在哺乳类,StAR底物转运过程被认为是调控类固醇合成的第一个限速步骤,在类固醇激素合成过程中发挥至关重要作用。在前期研究中,我们从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)分离出两种StAR基因(StAR1和StAR2),其中StAR1是哺乳类StAR的直系同源基因,而StAR2是硬骨鱼类的复制基因。StAR1基因主要在精巢Leydig细胞和头肾肾间细胞表达,我们推测StAR1可能在促进精巢雄激素和头肾可的松合成过程中有重要作用。而StAR2只在卵巢间质细胞和精巢Leydig细胞表达,推测StAR2可能在性腺雌激素和雄激素合成过程中具有重要作用。重要的是,我们发现只有StAR2在性别决定和分化早期的XX性腺表达,提出StAR2,而不是StAR1可能调控鱼类性别决定与分化早期雌激素合成的过程。但是到目前为止,关于StAR调控鱼类类固醇合成的直接证据,特别是在硬骨鱼类性腺发育和性别分化过程中的作用,仍需要通过功能实验进一步验证。因此,本论文以尼罗罗非鱼为材料,通过CRISPR/Cas9靶向基因敲除技术分别建立StAR1和StAR2的突变体,分析了基因突变体性腺组织学形态、基因表达和激素合成水平等变化,以期深入研究两种StAR在罗非鱼类固醇激素合成中扮演的角色,阐明StAR通过调控不同类固醇激素合成,进而调控硬骨鱼类性别决定与分化的分子机制。本论文主要研究结果如下:1)StAR基因突变系的建立。利用CRISPR/Cas9靶向基因编辑技术,在罗非鱼分别敲除StAR1和StAR2,获得StAR1的杂合突变体和StAR2的纯合突变体。基因敲除的靶位点位于StAR1和StAR2的第2个外显子上,选择靠近PAM(Protospacer adjacent motif,PAM,原型间隔基序)区的限制性内切酶Bsl I和Pst I,分别用于StAR1和StAR2 F0代基因敲除阳性鱼的筛选。将StAR1和StAR2突变的F0代XY阳性鱼和野生型XX雌鱼杂交,获得F1代杂合突变体。选取StAR2移码突变(-8bp)的XY与XX F1代交配获得纯合突变的F2代。2)StAR1基因突变对精子发生和育性的影响。在孵化后90天,野生型XY鱼的精巢充满各时期生殖细胞,包括精原细胞、精母细胞以及精子细胞等,而在StAR1嵌合突变XY鱼的性腺中,未发现进行减数分裂的各级生精细胞,精子发生出现延迟。免疫组化实验结果显示,在StAR1突变的XY性腺中,催化雄激素的合成关键酶和生殖细胞标记基因Vasa的表达明显减少。Real-time PCR结果发现,生殖细胞减数分裂相关的分子标记基因(spo11、piwil1、dazl和Scp3)表达量显著性降低,cyp11b2的表达也下调,并且EIA检测发现血清中11-KT的水平也降低。这些结果表明,StAR1可能在雄激素合成和精子发生过程中有重要作用。我们推测,StAR1突变可能影响了雄激素的合成,进而导致精子发生明显延迟,表明StAR1可能在精子发生启动过程中有重要作用。在孵化后180天,StAR1突变XY鱼的生殖细胞减数分裂部分恢复,可观察到各级生精细胞。将突变XY个体与正常XX个体授精发现,在受精后9天胚胎的存活率为40%左右,表明StAR1基因突变XY个体是可育的。3)StAR2基因突变对精巢分化和精子发生的影响。在孵化后90天,对照组XY性腺充满进行减数分裂的各级生精细胞,而StAR2~(+/-)杂合敲除XY性腺的生殖细胞正常分裂增殖,减数分裂起始也出现延迟。免疫组化结果表明,StAR2~(+/-)精巢中Leydig细胞标记基因Cyp11b2和生殖细胞标记基因Vasa的表达减少,并且精巢中充满表达Dmrt1的Sertoli细胞。这些结果说明在精巢发育早期,StAR2基因的杂合突变同样会导致精巢精子发生的启动过程延迟。在孵化后300天,StAR2~(+/-)精巢中精子发生部分恢复,可见各级生精细胞。免疫组化检测发现,在StAR2~(+/-)性腺检测到精母细胞标记基因PCNA的阳性信号。与对照雄鱼相比,Cyp11b2和Cyp17a2表达的Leydig细胞异常聚集。Real-time PCR检测结果表明,StAR2~(+/-)精巢中生殖细胞相关基因(vasa和pcna)表达量显著降低,而体细胞细胞表达基因cyp11b2和cyp17a2的表达显著上调,表明精巢发育并未完全恢复正常。在孵化后70天和90天的StAR2~(-/-)XY性腺中,组织学观察发现StAR2缺失导致XY精巢发育受阻并且精子发生启动过程延迟。在孵化后120天,StAR2~(-/-)精巢中精小叶发育紊乱,输精管没有形成。免疫组化检测发现,在孵化后70天StAR2~(-/-)精巢中,Vasa仅在少数精原细胞和精母细胞中表达,在StAR2~(+/+)和StAR2~(-/-)精巢都检测到雄性特异基因Dmrt1的表达。Real-time PCR检测结果表明,在孵化后90天,StAR2~(-/-)性腺中生殖细胞减数分裂相关基因(vasa、dazl和sycp3)表达水平显著降低,类固醇合成酶基因cyp11a、cyp17a1和3β-HSD-I以及Sertoli细胞标记基因dmrt1的表达水平未发生显著变化,StAR1的表达水平显著高于对照组,而cyp11b2的表达却显著低于对照组。EIA检测发现StAR2~(-/-)个体血清中11-KT的水平也显著低于对照组。说明StAR2缺失影响了雄性性腺生殖细胞的增殖和精子发生过程。我们认为,StAR2可能在雄激素合成和精子发生中有重要作用。4)StAR2纯合突变对雌激素合成和卵巢发育的影响。在孵化后90天,可以在StAR2~(-/-)纯合突变卵巢中观察到I、II时相卵母细胞,Cyp19a1a的表达与XX野生型相比没有明显差异。然而,在孵化后40天和90天的StAR2~(-/-)卵巢中检测到雄性高表达的基因StAR1,而在野生型卵巢中则检测不到StAR1阳性信号。有趣的是,我们在StAR2~(-/-)卵巢中还检测到精巢Leydig细胞标记基因Cyp11b2的表达。Real-time PCR检测结果表明,StAR2~(-/-)卵巢中减数分裂相关基因vasa和spo11表达水平显著降低,雌激素合成关键酶基因cyp19a1a表达显著降低,StAR1和cyp11b2的表达却明显上调。EIA检测发现StAR2~(-/-)个体血清中E2的水平也降低。同时,在孵化后90天,组织学观察发现,StAR2~(-/-)卵巢发育紊乱,表现为卵母细胞减少,而体细胞增多,表明StAR2可能在雌激素合成和卵巢早期发育中有重要作用。在孵化后120天,免疫组化检测到StAR1和Cyp11b2也表达于StAR2~(-/-)卵巢。实验结果表明,StAR2基因敲除导致卵巢中的体细胞雄性化。但StAR2基因缺失不会引起性逆转,我们推测可能是由于StAR1基因表达上调能够补偿StAR2的功能,参与调节雌激素的合成。因此,还需要建立StAR1和StAR2的双敲除模型开展更进一步的研究。综上所述,我们在尼罗罗非鱼中通过CRISPR/Cas9靶向基因敲除技术现已获得StAR1突变的F1代杂合子和StAR2突变的F2代纯合子。我们发现StAR1和2缺失在早期阶段会影响精巢发育和精子发生启动延迟过程,我们推测StAR1和StAR2可能都参与调节雄性个体的雄激素合成和精子发生。研究发现,StAR2在XX个体纯合敲除导致卵巢体细胞出现雄性化现象,表明StAR2在卵巢分化早期有重要作用。此外,XX个体并没有发生性逆转,这可能是因为StAR1会补偿其功能在雌激素合成和卵巢发育过程中发挥作用。因此,在本研究的基础上,亟待通过建立筛选StAR1和StAR2双敲除模型,深入解析StAR在雌、雄激素合成和性腺发育过程中的作用。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q953

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 周林燕 ,张修月 ,王德寿;脊椎动物性别决定和分化的分子机制研究进展[J];动物学研究;2004年01期
2 王德寿,吴天利,张耀光;鱼类性别决定及其机制的研究进展[J];西南师范大学学报(自然科学版);2000年03期
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1 江东能;Gsdf和Wt1在罗非鱼性别分化和性腺发育中的功能研究[D];西南大学;2016年
【共引文献】
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1 王鑫;王淑红;;维甲酸X受体在杂色鲍性腺发育中的调控作用研究[J];安徽农业科学;2015年23期
2 王莉;孙伟;储经乾;刘颖;史思瑞;葛楚天;钱国英;;中华鳖SOX9基因在胚胎期性腺中的表达模式及在性逆转中的表达变化[J];水产学报;2014年09期
3 陆成伟;袁重桂;阮成旭;张磊;;淡水和9‰盐度条件下红罗非鱼和尼罗罗非鱼正反交试验[J];安徽农业科学;2014年08期
4 雷志华;李玉华;;哺乳动物性别决定基因研究进展[J];郑州师范教育;2013年06期
5 陈维;王昌留;;Sox9基因参与动物性别决定与分化的分子机制[J];鲁东大学学报(自然科学版);2012年02期
6 李云航;孙鹏;;鱼类性别决定机制及相关基因研究进展[J];现代渔业信息;2011年12期
7 施志仪;程千千;宋佳坤;轩兴荣;;西伯利亚鲟Sox9基因cDNA全长克隆、序列分析及其表达检测[J];水产学报;2010年05期
8 朱佳杰;林勇;李丽萍;蒋宗良;张永德;陈忠;罗永巨;蒋和生;甘西;;吉富罗非鱼雌雄群体遗传差异的SSR分析[J];基因组学与应用生物学;2010年01期
9 詹光杰;王慧丽;奚耕思;;雄激素受体类似物在雄性拟黑多刺蚁性腺中的表达和定位[J];安徽农业科学;2009年18期
10 江玲霞;李纪委;李美丽;方威;李贵强;徐银学;;哺乳动物的性别决定相关基因的作用机理[J];生物技术通报;2009年01期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 董林松;大黄鱼和黄姑鱼基因组选择研究[D];集美大学;2018年
2 陈锦霖;翻译延伸因子eEF1A1b和42Sp50在罗非鱼配子发生中的功能研究[D];西南大学;2018年
【二级参考文献】
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1 焦保卫,王德寿,邓思平;爬行动物温度依赖性性别决定研究进展[J];动物学杂志;2002年04期
2 黄晓,周荣家,程汉华,郭一清,余其兴;两种淡水鱼类的Sox基因(英文)[J];动物学报;1998年02期
3 常重杰,周荣家,余其兴;PCR扩增泥鳅和大鳞副泥鳅SRY盒基因[J];动物学杂志;1998年01期
4 常重杰,余其兴;大鳞副泥鳅ZZ/ZW型性别决定的细胞遗传学证据[J];遗传;1997年03期
5 田志宏;性别决定与性染色体[J];生物学通报;1996年10期
6 周荣家,余其兴,程汉华;SRY盒基因在斑马鱼和胡子鲇中的保守性分析[J];遗传;1996年01期
7 喻传洲,余梅,龙良启;禽类性别及性别控制的研究进展[J];华中农业大学学报;1994年06期
8 李英文,林浩然;鱼类性转变研究的进展[J];水产学报;1994年04期
9 常重杰,杜启艳,路淑霞,卢龙斗;泥鳅和大鳞副泥鳅性腺细胞H-Y抗原的检测[J];河南师范大学学报(自然科学版);1994年03期
10 范兆廷,寮苏祥;鱼类的雌核发育、雄核发育和杂种发育[J];水产学报;1993年02期
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1 孙运侣;尼罗罗非鱼性别特异分子标记的筛选、应用及性别决定候选基因sdY的分子克隆[D];西南大学;2013年
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1 程宇昂;;尼罗罗非鱼鹭雄1号[J];农村百事通;2017年10期
2 ;溶氧和鱼体大小对尼罗罗非鱼生长性能等的影响[J];渔业现代化;2015年05期
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6 郑咸雅;尼罗罗非鱼前景看好[J];渔业致富指南;2003年01期
7 郑宝成;尼罗罗非鱼池塘套养加州鲈对比试验[J];中国水产;2002年11期
8 李虹,邬清碧,蒋华敏;单雄性罗非鱼与尼罗罗非鱼池塘养殖对比试验[J];内陆水产;2001年10期
9 任维美;尼罗罗非鱼对棉籽饼饲料利用率高[J];饲料研究;1999年02期
10 吴福煌,刘寒文;尼罗罗非鱼抗寒性状若干指标初探[J];淡水渔业;1997年05期
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1 周涛;陈良标;;低温压力下尼罗罗非鱼肾脏转录组学变化[A];2017年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2017年
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3 余嘉欣;吴芳;孙成飞;叶星;董浚键;田园园;;尼罗罗非鱼γ-干扰素基因的克隆、表达以及在斑马鱼中的转植研究[A];2015年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2015年
4 林树根;王寿昆;林旋;李志纲;黄玉章;;尼罗罗非鱼肥大细胞中类胰蛋白酶免疫组化的研究[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2008年
5 魏秀芳;李炳喜;尹晓雪;仲小芳;李远;郭政;叶剑敏;;尼罗罗非鱼白介素6的克隆表达及性质分析[A];2017年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2017年
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8 江星;张耀光;王川;黄小铭;金丽;;量子点对雄性尼罗罗非鱼血液的影响[A];中国西部动物学学术研讨会论文摘要汇编[C];2012年
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中国重要报纸全文数据库 前5条
1 钟实;泰国尼罗罗非鱼 养殖潜力大国内外市场良好[N];中国渔业报;2007年
2 中国水产科学研究院;“一种尼罗罗非鱼精子超低温保存的方法”获国家发明专利授权[N];中国渔业报;2014年
3 中国水产科学研究院;“一种鉴别奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交鱼的方法”获国家发明专利授权[N];中国渔业报;2014年
4 郑惊鸿;中国援助南太平洋7岛国成效显著[N];农民日报;2008年
5 ;第四届全国水产原种和良种审定委员会第五次会议审定通过品种简介[N];中国渔业报;2013年
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1 吴天利;脊椎动物ZP基因的生物信息学分析及尼罗罗非鱼ZP基因的表达模式[D];西南大学;2018年
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3 杨东;尼罗罗非鱼性别决定机制和性别相关的分子标记[D];华中农业大学;2006年
4 张伟妮;“新吉富”尼罗罗非鱼N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的性质研究[D];福建农林大学;2014年
5 岳蒙蒙;性类固醇激素对尼罗罗非鱼雌雄生长差异与生长相关基因表达的影响[D];上海海洋大学;2017年
6 王伟伟;基于高通量测序的尼罗罗非鱼(Oreochomis niloticus)性别二态性研究[D];山西农业大学;2016年
7 宁丽军;尼罗罗非鱼过氧化物体增殖激活受体(PPARα)激活及其降脂机制研究[D];华东师范大学;2016年
8 范武江;萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)及其杂交后代耐盐相关基因的研究[D];上海海洋大学;2011年
9 蒋高中;20世纪中国淡水养殖技术发展变迁研究[D];南京农业大学;2008年
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1 张武凤;尼罗罗非鱼IgM、IgT重链基因的克隆及表达[D];西南大学;2015年
2 马赫;tsp1突变对尼罗罗非鱼配子发生的影响[D];西南大学;2018年
3 蔡静;StAR在尼罗罗非鱼性腺分化和配子发生过程中的功能研究[D];西南大学;2018年
4 刘菲菲;高温诱导尼罗罗非鱼雌鱼性腺细胞凋亡及相关基因表达变化的研究[D];山东农业大学;2018年
5 索晏彤;盐度应激对尼罗罗非鱼的免疫损伤及β-葡聚糖的缓解作用研究[D];华东师范大学;2018年
6 于杰;尼罗罗非鱼能量代谢相关基因的多态性及遗传效应研究[D];广西大学;2018年
7 李梦晓;低氧应激对尼罗罗非鱼糖脂代谢的影响及红景天苷的调节作用研究[D];华东师范大学;2018年
8 徐志鑫;盐度胁迫下尼罗罗非鱼的能量代谢及其胆固醇营养的研究[D];华东师范大学;2017年
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