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《西南大学》 2019年
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斑马鱼前肾突变体的遗传筛选及精子冻存

黄月玥  
【摘要】:肾脏是人体的重要器官,主要行使两方面功能,一是清除血液中由细胞生命活动产生的含氮废物,二是维持体液渗透压和pH值稳定。肾脏对生命活动的维持至关重要,肾脏功能缺陷和紊乱所导致的肾病种类繁多,发病率高,目前的研究表明肾病的发病原因,特别是人类的遗传性肾脏疾病是由于调控肾脏发育的相关基因突变导致的,因此,肾脏发育的研究有利于对肾脏疾病发病机理的认识、肾病快速诊断方法的建立、肾病临床治疗策略新的探索。在脊椎动物由低等向高等进化的过程中,哺乳动物由中间中胚层形成的肾脏出现了三种形态和结构逐渐复杂化的形式:前肾、中肾以及后肾。在鱼类以及两栖动物中,前肾会在胚胎期形成,然后形成最终的成熟肾脏-中肾。现有的研究表明在分子进化水平上肾脏发育是保守的,低等动物与高等动物具有类似的肾脏发生过程。斑马鱼是一种肾脏结构简单的低等脊椎动物,其前肾仅由两个肾单元组成,包含了哺乳动物肾脏中的所有细胞类型,而且调控前肾器官形成的转录因子在哺乳动物的肾脏发育中有高度保守的功能,因此斑马鱼前肾是一种良好的肾脏研究模型。斑马鱼作为模式生物,有较多显著的优势。斑马鱼的卵子采用体外受精方式;受精卵快速生长,在24小时内已经完成了三个胚层、胚胎体轴、以及血管、神经等组织或器官的发育;胚胎体外发育,且呈半透明状,便于体外观察;斑马鱼生长周期短,3个月即可性成熟;斑马鱼具有较强的繁殖能力,每条母鱼每次可产上百颗卵,且产卵间期短;斑马鱼体型小,约三至四厘米长;尤其是已经在斑马鱼中开发出了越来越多的应用研究技术,如基因敲除技术,转基因技术等;这些优势有利于实验室开展大规模的斑马鱼养殖以及科学研究。我们通过化学诱变剂ENU对斑马鱼进行诱变,使其在斑马鱼基因组中随机地引起突变,用正向遗传筛选的方法,筛选出感兴趣的前肾发育缺陷的突变体。这样可以更加系统、无基因歧视地研究调控肾脏发育的基因,为肾脏研究以及肾脏疾病的防治提供更多的科学依据。本次筛选采用经典的F2代自交产生F3代胚胎筛选隐性遗传突变的策略。目前关于斑马鱼肾脏突变体的筛选的研究报道基本是采用在显微镜下直接观察斑马鱼肾脏形态的方法,并不能分辨出表型不明显或表型出现较晚的突变体。为了弥补这一缺陷,我们利用碱性磷酸酶染色的方法对斑马鱼肾管进行染色标记,然后在显微镜下观察斑马鱼肾管的形态,并进行数据记录和结果分析。前期经过4代的传代和筛选,我们保留了 24个稳定遗传的F5斑马鱼肾脏遗传突变品系。通过碱性磷酸酶染色的结果分析,我们将这些突变体分为四大类,分别为肾管偏细型、肾管偏粗型、肾管短缩型以及肾嚢肿型。肾管偏细型共有11个品系,分别为V1、V6-A、V6-B、V7-C、V27-A、V29-A、V29-C、L27、L34、L38以及L48-7;肾管偏粗型共有5个品系,分别为V3-202-A、V7-B、V7-F、V19-A以及V19-B;肾管短缩型共有6个品系,分别为V3-202-B、V27-B、V29-B、V47、L48-6以及L76;肾管囊肿型共有2个品系V3-5及V43。为了获得更加单一稳定遗传的突变体,我们进行了 F6的重筛选。截止到成文,V1、V6-A、V6-B、V7-C、V27-A、V29-A、V29-C、L27、L34、L38、L48-7、V3-202-A、V7-F、V3-202-B、V27-B、V29-B、V47、L48-6、L76以及V43都已筛选出正确的F6突变体,而V19-A、V19-B以及V7-B和V3-5这四个F6家系虽经过多次自交,仍未筛选到突变体,这可能因为这4个F6家系中,成鱼的总数略少,公母比例失衡,造成我们难以筛选到目的突变体,我们已经采取补救措施,及时将鉴定的F5杂合子再次传代并饲养。由于斑马鱼前肾突变正向遗传筛选涉及的突变品系较多,且又经历了多次的筛选和传代。这期间为了维持及筛选这些斑马鱼突变品系耗费了实验室大量的人力和物力,占据了斑马鱼鱼房较多空间。为了维持24种我们筛选出的稳定遗传的突变品系,通过传代和筛选的方法并不能从根源上保证这些珍贵的品系不会丢失,同时为了节约更多的人力、物力和空间,我们对已筛选获得的斑马鱼前肾发育缺陷突变品系进行了精子冷冻保存。我们从每个品系中筛选出2至3条精壮的杂合子雄鱼,将其单独喂养,待其状态达到可以进行精子冻存的最佳状态后,即可冻存精子。为了确保冷冻保藏的精子可以长久保存,每一个品系至少需要冻存3个合格的精子备份。我们在冻存精子时,每个精子备份都需要同时冻存两管精子,一管精子是用于冻存保种,另一管的冻存精子于一定时间后复苏并进行体外受精以检测精子冷冻的效果。目前我们已经完成了 15种前肾发育缺陷突变品系的精子冻存保种,包括肾管偏细型的品系V1、V6-A、V6-B、V27-A、V29-A、V29-C、L34、L38 以及 L48-7,以及肾管短缩型的品系 V3-202-B、V27-B、V29-B、V47、L48-6、L76。每种品系保存至少3个精子备份,平均精子活力不低于40%,足以达到保种的要求。此外,我们还对实验室中其他ENU诱变筛选获得的消化器官发育缺陷斑马鱼品系进行了精子冻存,共完成了 21种突变品系的保种,每种品系不少于3个精子备份,平均精子活力不低于48%。同时,也对实验室里的基因敲除鱼系及转基因鱼系进行梳理和精子保种,总计完成了 53种基因敲除鱼系及49种转基因品系的精子冻存,每种鱼系不少于2个精子备份,平均精子活力达到42%以上。历时一年半,我们总计完成了实验室里的138种斑马鱼品系的精子冻存储藏,每种鱼系的精子冻存数量以及精子活力都达到了我们长久保种的目的。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R692

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