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多功能溶藻链霉菌的分离及其对铜绿微囊藻溶藻特性的研究

于燕  
【摘要】:随着水体富营养化和全球变暖的加剧,有害蓝藻水华已经成为越来越受关注的难问题。有害蓝藻水华可以通过降低水质、消耗水体中的氧气和产生有害的蓝藻藻毒素来破坏水生生态系统,威胁水生生物的生存和人类健康。微囊藻是淡水湖泊水华中最常见的优势蓝藻,也是水体中微囊藻毒素(MCs)的主要产生者。微生物控藻由于其具有的低成本、操作简单、环境友好和无二次污染等特点成为研究的热点,但实际应用还存在诸多难题。本文提出多功能溶藻菌的概念,即除了具有杀灭有害藻类,还有同时具有其它生物活性的菌株,包括但不限于拮抗其它有害微生物、抑制或降解藻毒素合成等。本文先从土壤中分离了大量拮抗植物病原菌禾谷镰刀菌的放线菌,然后从中筛选了一株对铜绿微囊藻有高溶藻活性,并能强烈抑制微囊藻毒素合成的菌株,最后对该菌株的溶藻特性、溶藻物质的基本特征、溶藻机制进行分析和研究,主要结果如下:1.多功能溶藻放线菌的分离与鉴定:从重庆紫色土壤中,通过平板对峙法分离出对禾谷镰刀菌和茄病镰刀菌具有拮抗效果的放线菌。将拮抗菌株与铜绿微囊藻进行共培养,发现一株名命为HG-16的菌株具有很强的溶藻活性,8 d的溶藻率达到了92.8%。HG-16的气生菌丝菌体呈白色,长时间培养后产生灰粉色孢子,其孢子链为直链形,孢子为短杆状。结合形态学和16S rRNA基因序列分析,HG-16被鉴定为Streptomyces amritsarensis。2.S.amritsarensis HG-16的溶藻特性研究:HG-16对测试的不同来源的铜绿微囊藻均表现出较好的溶藻效果,10 d溶藻率都在80%以上,对其它几种有害蓝藻如水华鱼腥藻、颤藻和席藻均具有较高的溶藻活性,且活性不受藻所带的附生菌影响;HG-16对铜绿微囊藻的溶藻效果随着藻液初始浓度的增加而降低,当藻细胞初始密度为1×10~5,1×10~6 cell/mL时,第6天的溶藻效率分别为91.1%,92.9%,而对初始密度为1×10~7 cell/mL的溶藻率为65.0%。HG-16在生长的稳定期分泌溶藻活性物质,通过间接的方式溶藻;HG-16的溶藻具有光依赖性,微囊藻的光合作用系统是HG-16攻击的目标;HG-16分泌的溶藻活性物质具有耐酸和耐碱性,在pH3-11范围内稳定,对高温敏感,当温度85℃时活性显著下降,但在121℃高温处理后仍然保持52.1%(t=5 d)的活性,表明HG-16的活性物质中既有高温敏感的,又有高温耐受的;HG-16的无菌上清液用蛋白酶处理后,溶藻活性不受影响,表明HG-16分泌的主要溶藻活性物质不是蛋白质类。3.HG-16无菌上清液对微囊藻细胞作用机制的初步研究:溶藻过程中藻细胞的形态变化表明,HG-16的菌丝会缠绕藻细胞,且分泌活性物质裂解藻细胞;藻细胞内的ROS含量与未处理的藻细胞相比,呈先上升后降低的趋势,说明HG-16造成了藻细胞的氧化胁迫;HG-16无菌上清液处理藻细胞后,细胞内的最大光化学量子产率(Fv/Fm)在6 h下降到0.05,且随时间进一步下降,至24 h已经检测不到Fv/Fm值,说明藻细胞的光合作用受到强烈抑制;用HG-16原菌液和上清液溶藻后,测定藻细胞内外藻毒素含量,结果表明HG-16能强烈抑制藻细胞微囊藻毒素的合成;RT-qPCR分析结果进一步证实,HG-16分泌的活性物质显著影响了铜绿微囊藻细胞的光合作用系统关键基因mcyB表达,快速并强烈抑制微囊藻毒素合成关键基因的表达。对HG-16的全基因组进行测序,发现HG-16带有至少7个质粒,用antiSMASH软件分析可能的活性物质合成途径,总共找到24个基因簇,包括11个NRPS/PKS(non-ribosomal peptide synthetases/polyketide synthases)的基因簇,分别合成羊毛硫肽化合物、萜类化合物、铁载体、聚酮类化合物、不依赖于核糖体的多肽类物质,其中一个21 kb的质粒上的T2PKS基因簇可能合成4种与已知物质无明显结构相似性的新聚酮类活性物质,这些基因簇可能参与新溶藻活性物质的合成,但还待进一步的验证。


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