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《西南大学》 2019年
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核盘菌存活因子基因SsSvf1功能研究

杜娇  
【摘要】:核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一种世界性分布的重要死体营养型植物病原真菌,可侵染400多种植物,对农产品的品质和产量造成巨大损失。病原菌在侵染过程中需抵抗或耐受由于活性氧爆发而造成的寄主氧化压力,但到目前为止,对核盘菌抵抗氧化胁迫的机制知之甚少。本研究前期发现核盘菌基因SsSvf1(SS1G_01919)在病原菌侵染寄主初期表达量显著升高,该基因编码一个酿酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)存活因子1(Svf1,Survive factor 1)的同源蛋白,SVF1能帮助酿酒酵母应对氧化胁迫并维持细胞活性。为揭示核盘菌抵御氧化压力及致病机理,本研究对核盘菌SsSvf1基因的功能进行了深入研究。利用生物信息学技术对SsSvf1基因进行分析,结果表明SsSvf1基因编码区全长1146bp,编码381个氨基酸,保守结构域分析表明其C端为存活因子1结构域(Survival factor 1,Svf1),通过构建系统进化树发现SsSvf1和灰霉(Botrytis cinerea)XP_001548941、白霉病菌(Sclerotinia borealis)ESZ99098聚为一个小的分支,说明三者的亲缘关系较近。利用实时荧光RT-PCR分析核盘菌SsSvf1基因表达模式,发现该基因在氧化应激和致病初期表达量显著升高,表明该基因的表达受氧化胁迫的诱导,并可能在致病过程发挥重要作用。本研究构建了SsSvf1基因的沉默载体,并通过PEG介导的原生质体转化技术获得了基因沉默转化子。对SsSvf1基因沉默转化子菌丝、菌落形态进行了观察,并对形成菌核的数量和干重进行统计,发现菌丝和菌落形态、菌核形成与野生型菌株无显著差异。相比于野生型,SsSvf1沉默转化子在添加了蔗糖、山梨醇和氯化钠的PDA培养基中生长受到显著抑制,表明SsSvf1参与核盘菌对高渗胁迫的抵御过程;在含有细胞壁抑制剂十二烷基硫酸钠和刚果红的培养基上,SsSvf1沉默转化子的生长也受到更显著的抑制,表明该基因与细胞壁完整性相关。在氧化胁迫下,SsSvf1沉默转化子生长更加敏感,表明SsSvf1与核盘菌应对氧化胁迫密切相关;通过氮蓝四唑(NBT)染色检测沉默转化子中的活性氧(ROS),结果发现该基因的沉默导致了ROS的过量积累。利用高效液相色谱对分泌的草酸进行定量分析,发现该基因的沉默并不会造成草酸积累量的变化;但沉默转化子在离体油菜叶片和拟南芥叶片上致病力显著降低,而人为造成伤口可以部分恢复沉默转化子的致病力;台盼蓝染色进一步表明沉默转化子的侵染垫形成异常,表明该基因与核盘菌侵染垫的形成密切相关。本研究表明该基因在核盘菌应对氧化等胁迫及致病过程中发挥重要作用。本研究构建了SsSvf1的FLAG融合表达载体,并通过PEG介导的原生质体转化获得SsSvf1融合FLAG标签转化子。通过RT-PCR和Western blot表明转化子表达了带有FLAG标签的SsSvf1蛋白。通过CO-IP和LC-MS/MS分析,鉴定了可能和核盘菌SsSvf1互作的蛋白,利用酵母双杂交对部分蛋白进行了互作验证,最终确定过氧化氢酶SsCat2(SS1G_00547)与SsSvf1互作,推测核盘菌SsSvf1很可能通过与过氧化氢酶互作调控侵染过程中的活性氧产生,并在核盘菌的致病过程中起关键作用。本研究解析了核盘菌SsSvf1基因在氧化应激、致病等过程中的作用,为揭示核盘菌致病机理提供了理论依据,也为菌核病的防治提供了重要的线索,此外,本研究也为探索其他真菌中SsSvf1同源蛋白的功能提供了重要参考。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:S432.44

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