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《西南师范大学》 2001年
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黄瓜(Cucumis Sativus L.)杂交种子纯度的RAPD鉴定

王和勇  
【摘要】: 随着分子生物学的迅猛发展,RAPD(随机扩增多态性DNA)标记技术已广 泛应用于生物学诸多领域。本文应用RAPD技术对黄瓜杂交种子纯度进行了鉴定, 并对RAPD技术的最适条件进行了探讨。 分析了模板DNA的制备与不同组织材料对RAPD的影响。利用改良的SDS方 法提取黄瓜干种子与一步法提取的黄花苗总DNA进行RAPD扩增,其结果与传统 的CTAB和SDS的结果一样。这两种方法不仅节约成本,且简单快速大大降低了DNA 的提取难度,适宜黄瓜杂交种子纯度鉴定。同时证明了不同组织材料对RAPD无 影响。 研究了RAPD的影响因素。结果表明:Mg~(2+)浓度的范围在1.5-3.0mmol.L-1; dNTPs浓度范围为0.15-0.25mmol.L~(-1);Taq聚合酶浓度范围为0.5-1.5U;模板DNA 浓度为20-100ng/反应以及引物浓度为0.2-0.4μmol.L~(-1)。此外,在对RAPD反应 体系优化时发现不同厂家以及不同生产时期的Taq聚合酶对RAPD有较大影响; 引物的碱基组成以及不同存放时间的引物对RAPD技术也有影响。 改进及优化了RAPD反应程序。DNA预变性94℃进行4min,94℃变性30sec, 37℃退火30sec,72℃延伸1min,循环35次后72℃再延伸7min,最后4℃保 存。 — — 鉴定和分析了品种真实性与亲本多态性。本文在筛选引物前进行了父母本以 及 F;代杂交种子品种真实性鉴定与亲本多态性分析,实验结果是:在利用 SI 00、 Sll33及51151引物鉴定的30粒巳代杂交种子时,结果发现有三粒假种子;父 母本的均一性好,在父本、母本各七粒种子内部之间的RAPD指纹图谱一样,均 未发现假种子:利用548、引71、S4犯、幻019、m062以及51375引物进行父母 本多态性鉴定时父母本都表现出丰富多态性。 筛选出应用于黄瓜种子纯度鉴定的引物和建立了亲本及其杂交种子的RAPD 指纹图谱。从 102条引物中筛选出了应用于黄瓜种子纯度鉴定的引物 32条:13 条偏母型引物、9条偏父型引物、5条互补型引物、2条特异型引物及3条缺失 型引物,他们所占比例依次为12.74%、8.82%、4.90%、1.96%和2.94%:利用四 条引物5293与5287、5297及5300鉴定黄瓜种子的纯度发现:4粒种子中有父 本混杂2粒,母本混杂1粒及6粒其它种子混杂,从而获得该黄瓜种子的纯度 为9o乃4%;并且建立了黄瓜早青二号父本几雄性系、早青二号母本民;雌性系 以及其杂交种子的RAPD的指纹图谱。 RAPD技术能够用来鉴定黄瓜种子纯度,而且在建立其反应体系与反应程序 后具有相当高的可靠性与准确性。
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