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《西南大学》 2006年
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球孢白僵菌降解寄主体壁的几丁质酶和蛋白酶的分子改良

范艳华  
【摘要】:昆虫病原真菌具有主动侵染宿主的特点,是自然界昆虫种群数目的重要调节因素,也是防治刺吸式害虫和鞘翅目害虫的有效手段,因此具有广阔的应用前景。但是,击倒害虫时间长和防效不稳定等缺点限制了昆虫病原真菌更广泛的应用。研究表明,昆虫病原真菌菌丝穿透体壁是其侵染致病的关键步骤。在此过程中,真菌要分泌蛋白酶、几丁质酶、脂酶等多种水解酶来降解昆虫体壁,其中几丁质酶和蛋白酶具有重要作用。 研究表明,在昆虫病原真菌中超量表达几丁质酶和蛋白酶基因可以提高菌株的毒力。为了进一步提高杀虫真菌的防治效果,本文采用DNA shuffling和结构域融合等技术对球孢白僵菌降解体壁的几丁质酶(Bbchit1)和蛋白酶(CDEP-1)基因进行分子改良。利用DNA shuffling技术对球孢白僵菌的几丁质酶基因Bbchit1进行定向进化,获得了几丁质酶活性提高的突变体;通过对不同来源几丁质结合域的比较,发现家蚕几丁质结合域与几丁质的结合能力最强。转基因结果表明,带有家蚕几丁质结合域的融合几丁质酶和融合蛋白酶均可以显著提高球孢白僵菌的毒力。该结果表明,几丁质结合域在提高杀虫真菌的毒力上具有重要作用。据我们所知,目前还未有利用DNA shuffling技术提高几丁质酶活性的成功例子,也未有在降解昆虫体壁水解酶上添加几丁质结合域提高昆虫病原真菌毒力的报道。主要研究结果如下: 1.Bbchit1的DNA shuffling 1.1 以大肠杆菌为展示菌DNA shuffling体系的建立 DNA shuffling中的关键技术是高效筛选体系的建立。本文选择大肠杆菌作为展示菌,根据菌落在几丁质平板上形成透明圈的大小筛选几丁质酶活性提高的突变体。因此,在大肠杆菌中表达的Bbchit1必须分泌到胞外并具有生物学活性。 比较了5种不同来源的信号肽对Bbchit1分泌的影响。结果表明:1)胡萝卜欧氏杆菌果胶酶PelB信号肽引导Bbchit1分泌的能力最强;2)低温有利于Bbchit1在周质空间和胞外的累积。在18℃,胞外Bbchit1的产率是37℃的10倍。根据以上结果,选用PelB信号肽作为Bbchitl shuffling筛选体系的前导肽,并采用18℃低温筛选shuffling文库。 1.2 通过DNA shuffling获得几丁质酶活性提高的突变体 经过三轮DNA shuffling,筛选了约1.5×10~5个克隆,最终获得两个几丁质酶活性分别提高了36%和56%的突变体shu-1和shu-2。其中,shu-1突变发生在V251E,shu-2突变发生在D71N和A281E。shu-1和shu-2的Km值低于野生型几丁质酶,
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S476.1

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【引证文献】
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【参考文献】
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6 申圭良;浏阳霉素毒性及防螨效果研究[D];湖南农业大学;2010年
7 辛静;一种绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的基因克隆、表达及其特性分析[D];西南大学;2011年
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【同被引文献】
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10 王伟霞;李福后;;微生物几丁质酶的研究进展[J];安徽农业科学;2007年32期
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1 郝之奎;Chitinolyticbacter meiyuanensis的筛选鉴定及其发酵产几丁质酶研究[D];江南大学;2011年
2 张婕;嗜热真菌热稳定几丁质酶基因的克隆、表达与分子改造[D];山东农业大学;2010年
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4 刘东;苏云金芽孢杆菌几丁质酶特性分析及其基因启动子序列的确定[D];南开大学;2010年
5 王艳君;角毛壳菌Chi58基因克隆与密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达[D];哈尔滨工业大学;2009年
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10 屈明博;亚洲玉米螟几丁质合酶基因表达与生理功能研究[D];大连理工大学;2012年
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1 金香;几丁质降解菌的筛选、鉴定及酶学特性的研究[D];哈尔滨工业大学;2007年
2 姚祥春;气单胞菌产几丁质酶的工艺条件优化和应用初探[D];浙江工业大学;2008年
3 刘丹;产几丁质酶渤海丝状真菌(Alternaria tenuissima)的筛选、鉴定及产酶研究[D];天津师范大学;2012年
4 于恺;嗜热子囊菌光孢变种几丁质酶基因的克隆和表达[D];山东农业大学;2008年
5 熊晶;产几丁质酶菌株的筛选与鉴定及几丁质酶酶学性质研究[D];中南大学;2009年
6 陈红;广谱抗病虫几丁质酶产生菌的筛选与几丁质酶分子生物学研究[D];四川农业大学;2002年
7 郑秀丽;几丁质酶产生菌的筛选鉴定及几丁质裂解酶基因的克隆与表达[D];四川农业大学;2006年
8 张荣奎;土壤中产几丁质酶菌株的筛选、鉴定、产酶条件及酶学性质的研究[D];华侨大学;2006年
9 古丽皮艳;具有抑菌作用的几丁质酶产生菌的筛选及产酶条件研究[D];西北农林科技大学;2006年
10 夏秋瑜;几丁质酶高产菌株的筛选及酶法制备几丁寡糖的研究[D];华南热带农业大学;2006年
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