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《西南大学》 2007年
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有机小分子光谱探针在铜离子和DNA分析中的应用

龙云飞  
【摘要】: 在大量文献调研的基础上,本论文以共振光散射(RLS)技术和荧光分析技术为研究手段,重点以提高RLS技术中选择性和建立简单、快速的荧光分析方法为目标。通过开发一些有机小分子光谱探针的潜在应用价值,和设计合成出有应用价值的新有机小分子光谱探针,最终建立铜离子和DNA的分析方法。深入探讨有机小分子光谱探针的结构与性质之间的内在关系,为筛选和合成其它的类似有机小分子光谱探针提供理论参考。主要的研究内容分为两个部分。 第一部分主要介绍以有机小分子为光谱探针建立的光散射定量分析方法,研究内容有: 1.与文献报道的在技术上提高RLS方法的选择性不同,本文拟从分子结构上探讨提高RLS技术选择性的方法。我们基于化学选择性反应的原理,设计合成了一种新的酰胺内配体N,N′-双(2-氨基苯基)草酸二酰胺(NAPO)。该试剂在中性介中,能和铜离子选择性地发生化学反应,并导致强烈的光散射增强现象。基于此现象,建立了一种选择性地测定铜离子的方法。方法的线性范围是0.9-31.0μmol/L,检出限(3σ)为97.6 nmol/L,相对于铜离子浓度的7倍量的常见金属离子,对测定结果影响不大。用于环境水样中铜离子含量的测定,不需要对样品进行复杂的预分离。机理研究表明,NAPO与铜离子之间的反应能形成一种群集体(Cluster),这种群集体的形成导致体系的光散射信号显著地增强。与通常需要将待测定的物质与其共存物进行分离或者给仪器配备必要的附件装置等提高RLS的选择性的方法相比,我们建立的方法更加简单、方便。 2.用共振光散射光谱,紫外可见光谱,圆二色光谱,和散射成像技术研究了在溴化十六烷基三甲基铵存在下,氨基黑10B与DNA的相互作用。研究结果表明,在pH 11.55的碱性介质下,溴化十六烷基三甲基铵、氨基黑10B、及DNA之间可以发生相互作用形成三元复合物。该复合物在233.3和642.8 nm处表现出圆二色性产生明显的负Cotton效应,并在469.0 nm波长处有一特征RLS峰。结果还显示,在469.0 nm波长处RLS强度的增强值与DNA浓度呈良好的线性关系,基于此现象建立了一种测定DNA的新方法,该方法测定鱼精DNA(fsDNA)和小牛胸腺DNA(ctDNA)的线性范围分别是0.03-1.0和0.05-1.5μg/mL,检出限(3σ)分别为7.3和7.0 ng/mL,方法能成功用于合成样中DNA的含量分析。 3.基于溴化十六烷基三甲基铵存在下,苋菜红与DNA的相互作用,建立了一种双波长共振光散射(DRLS)比率法,并成功用于DNA定量测定。用共振光散射光谱,紫外可见光谱,和圆二色光谱证明,在pH 5.72的Britton-Robinson缓冲介质下,溴化十六烷基三甲基铵、苋菜红、及DNA之间可以发生相互作用形成三元复合物。该复合物在256.0和528.0 nm处表现出圆二色性产生明显的负的Cotton效应,并在570.0 nm波长处有一特征的RLS峰。基于三元体系的RLS光谱与溴化十六烷基三甲基铵、苋菜红组成的二元体系的RLS光谱的比率谱线,选取608.0和260.0 nm作为双波长比率法的两个波长。通过比较以最大散射波长570.0 nm处的RLS强度建立的测定方法(RLS),以及在608.0和260.0 nm处RLS强度的比(I_(608)/I_(260))建立的测定方法(DRLS)的一些分析参数,发现RLS和DRLS的检出限分别是6.5和1.0 ng/mL。表明DRLS比RLS法更有优越性。 第二部分介绍有机小分子光谱探针在DNA杂交和多态性检测方面的应用,主要研究内容包括: 1.基于RLS光谱及TEM测定,研究了八种有机小分子(OSMs)醌亚胺类染料,包括吖啶黄(Acridine Yellow,AV),中性红(Neutral Red,NR),吖啶橙(Acridine Orange,AO),灿烂甲酚蓝(Brilliant Cresyl Blue,BCB),硫堇(Thionin,TN),天青A(Azur A,AA),天青B(Azur B,AB),亚甲基蓝(Methylene Blue,MB)分别与单链DNA(ssDNA)和双链DNA(dsDNA)的相互作用。机理研究表明,OSMs与dsDNA的沟槽作用依赖于dsDNA的G-C碱基序列以及OSMs的体积大小。AY与dsDNA作用后能有效地减小dsDNA骨架的负电荷,导致AY与dsDNA形成的复合物之间的相互聚集,并导致大的颗粒的形成和强烈的RLS强度增强现象。利用增强的RLS信号,能够检测DNA的杂交和错配。该方法不需要对探针DNA和目标DNA进行标记。由于AY放大dsDNA的RLS信号最为显著,所以其被选择为一种模型化合物进行更深入的研究。 2.通过红外光谱和质谱证明了5′-腺苷单磷酸(dAMP)、5′-鸟苷单磷酸(dGMP)、和胞嘧啶(C)中的氨基能分别和邻苯二甲醛-β-巯基乙醇组成的混合试剂(OPAME)反应生成巯基取代的异吲哚类化合物。而胸腺嘧啶(T)由于没有一级氨基,不能和OPAME反应形成巯基取代的异吲哚类化合物。研究还发现,单链DNA由于是以自由的非折叠形式存在,其碱基上的氨基被充分地暴露于溶液中,很容易与OPAME发生化学反应生成一种具有强的荧光发射的异吲哚类化合物。而当单链DNA如果先和其互补的DNA序列杂交后,由于双螺旋结构的形成,使碱基中的氨基被包裹在双螺旋结构的里面,导致其与OPAME接触的机会减小,从而很难生成有强的荧光发射的异吲哚类化合物。基于OPAME与单、双链DNA反应活性的不同,建立了一种测定DNA杂交和错配的方法。该方法能实现可视化检测。 3.研究发现,银离子对得克萨斯红修饰的寡聚核苷酸(P)的荧光有较强的猝灭能力,然而当P先与其完全互补的寡聚核苷酸序列(T)杂交后,银离子对所形成的杂交复合物的荧光猝灭效果明显降低。基于这一现象,建立了一种测定DNA杂交和碱基错配的方法。该方法和传统的分子信标相比,主要优点是只需要对探针分子的一端进行标记,另外由于在探针分子中不需要象分子信标中“颈—绳”的结构形式,因此其与目标DNA杂交时需要的时间减小,有效地提高了检测的效率。整个检测过程在十分钟左右就能完成。在蛋白质组学和后基因时代,建立这种简单快速的测定特定序列的DNA、DNA序列的突变、或错配的方法,对病原体检测和防治、生物医学研究、药物的开发和应用等方面是非常有意义的。 通过上述两部分的研究,进一步拓宽了有机小分子光谱探针的研究内容和应用范围,为探索其它有机小分子探针在生化分析中的应用研究提供了实验和理论参考。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q503

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