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《西南大学》 2007年
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化学发光成像分析的研究

罗丽荣  
【摘要】: 化学发光(Chemiluminescence,CL)分析因其具有仪器设备简单、检出限低和线性范围宽等优点,已被应用于环境科学、临床医学、药学、生命科学、材料科学等领域。伴随着CL分析的发展,CL信号的检测技术取得明显进步,既可以利用传统的光电倍增管(Photomultiplier,PMT)测CL信号,也可以利用具有高灵敏度、高分辨率的CL成像装置检测发光信号,利用CL成像技术可对低至单光子水平的光进行定位及定量检测。当发光信号的空间分布体现了重要的分析信息时,成像检测技术更有优势。 本论文的研究工作主要由化学发光阵列成像平台的建立;化学发光免疫成像分析和自发电池激发的电化学发光成像分析三大部分构成。 1化学发光阵列成像平台的建立 CL成像分析主要包括微孔版、微阵列及微型化装置中的定量检测;基于酶、免疫组织化学和原位杂交反应的显微成像分析;生物体的发光成像分析等。然而,CL成像不同于荧光成像,在进行荧光成像时,在一定波长光的激发下,产生稳定的光信号,光信号不随时间而变化,我们可在任一段时间内积分,获得荧光强度,然而,CL信号是时间的函数,CL强度随时间而改变。大多数CL反应是快反应,发光在数秒内便完成,因为反应的引发与数据采集间存在延迟时间,利用传统的的CL成像方法不能检测这样的快反应。因而现有的CL成像分析只能够检测一些慢CL反应,或者将快发光反应转化为慢发光反应才能进行成像。例如辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)催化的鲁米诺与H_2O_2间的CL反应是快发光反应,不适合成像分析,通常要加入对碘苯酚等增强剂增强发光强度并延长发光时间。然而,很难将多数快CL反应转变为慢反应。即使将一些慢发光反应用于成像分析,最大发光强度仍然不能被CCD捕获到。例如,加入增强剂的鲁米诺/H_2O_2/HRP体系,在几十秒内,发光强度迅速增加并达到最大值,随后缓慢的降到与背景值相当的数值。然而,在几十秒内,操作者很难将所有CL试剂手动地加入到96孔、384孔酶标板或微阵列系统中,CL反应过程的信号不能全部被记录下来,在已开始反应的孔中,最大发光信号将被错过。这将导致检测发光信号的灵敏度相对较差。并且,如果采用手动加样方式将CL试剂加到微孔板或微阵列中,由于CL反不能在同一时间被引发,将导致CL信号的重现性较差。即使采用自动加样系统,反应的引发及信号采集之间的延迟时间仍然存在,这是传统CL成像方法存在的问题。 我们利用鲁米诺/血红蛋白/对碘苯酚CL反应体系作为模型,建立了一种新的在线调控的CL阵列成像平台,解决上述问题。众所周知,在碱性介质中,鲁米诺能产生很强的CL信号,而在酸性条件下,不能产生CL信号。所以,我们设想可以通过控制反应的pH值引发并控制CL反应。最终的实验结果表明利用本方法提高了检测的灵敏度。这种反应可控的CL成像分析平台的建立,将使快CL反应的成像检测成为可能。 (1)反应可控的化学发光成像分析的设计及应用 设计了反应可控的CL成像分析方法。本方法通过控制反应的pH值引发CL反应,并获得了很高的灵敏度。反应的pH值由在线产生的氨气调节,氨气由NaOH溶液与NH_4Cl溶液反应产生,氨气的量可以通过改变NaOH溶液的浓度,进样时间及流速来调节,也可以通过改变NH_4Cl溶液的浓度来控制。96孔酶标板各孔中的CL试剂吸收氨气后,pH值从相同的起始值持续增加,相对CL强度随pH值增加而增加。基于以上的设计,96孔酶标板上的CL反应在同一时间被引发,每孔中整个CL反应过程的信号可以被记录下来。从而获得高的灵敏度及良好的重现性。试验了鲁米诺/H_2O_2CL体系,用于测定血红蛋白(Hb)。CL强度与Hb浓度在1.0×10~(-9)~1.0×10~(-7)mol/L范围内呈线性,检出限为3.0×10~(-10)mol/L(3s),对1.0×10~(-8) mol/L的Hb进行11次平行测定,相对标准偏差(R.S.D.)为2.7%。 2化学发光免疫成像分析 本论文的第二部分的研究工作主要由两部分内容构成:基于鲁米诺增强化学发光(ECL)体系的免疫成像分析和基于草酰酯CL反应的免疫成像分析。并应用到重组人肿瘤坏死因子a(rhTNF-a),金黄色葡萄球菌肠毒素C_1(SEC_1),白介素6(rHuIL-6)和β-人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)的检测。 (1)化学发光成像分析法检测人血清中的肿瘤坏死因子a 设计了一种简单、灵敏、高通量的分析方法用于重组人肿瘤坏死因子(recombinant human tumor necrosis factor-a,rh TNF-a)的检测。本法具有酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)法的特异性、增强化学发光法(ECL)的高灵敏度及CL成像分析高样品通量等优点。透明的96孔板被用做固相载体。基于ELISA分析法中双抗体夹心法的原理,将对rh TNF-a抗原具有特异结合能力的一种抗体作为包被抗体,另一被辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体作为酶标抗体。一台带有低温冷却装置的CCD成像系统被用于检测CL信号。CL强度值与rh TNF-a浓度在9.0~312.0 pg/mL范围内呈良好线性关系,检出限为1 pg/mL(3s)。本法已被成功地用于人血清中的rh TNF-a的检测,对78.0 pg/mL rh TNF-a 8次平行测定结果的R.S.D.为4.7%,利用标准加入法所得回收率结果为94.0~108.2%,实验结果表明本方法具有实际应用的可行性。 (2)化学发光免疫成像分析法测定牛奶和水中的金黄色葡萄球菌肠毒素C_1 设计了一种灵敏、简单、快速及高通量的方法测定金黄色葡萄球菌肠毒素C_1(staphylococcalenterotoxin C_1,SEC_1),本方法具有ELIsA法的特异性,增强化学发光分析法(ECL)的高灵敏度,及成像分析法高通量检测的优势。基于双抗体夹心法的免疫反应原理,以96孔酶标板作为固定化载体。用一台商品化的带有低温冷却装置的CCD成像系统检测CL信号。在最佳实验条件下,发光强度值与SEC_1浓度在8.0~125.0 ng/mL范围内呈良好线性关系(r~2=0.9976),检出限为0.5 ng/mL(3s),对25.0 ng/ml SEC_18次测定结果的R.S.D.为6.0%。将本方法用于检测牛奶和水中SEC_1含量,测定结果与ELISA法相吻合。 (3)以纳米金为载体的化学发光免疫成像分析的研究及应用 以微孔板为载体的ELISA分析因其具有的高灵敏度和好的特异性被广泛应用于免疫分析。聚苯乙烯因其具有光学透明性并且表面性质可改变,成为应用最为广泛的固定相载体。未修饰的聚苯乙烯表面带有长的碳氢链,会排斥水及亲水性分子,吸引疏水性分子。大的亲水性分子一般都带有疏水链,会使分子吸附在聚苯乙烯表面。但需要很长的孵育时间、较高的物质分子浓度和严格的控制温度等条件,以防止物质分子从聚苯乙烯表面被洗脱下来。因此,亟需建立更好的的固定化方法以满足免疫分析的需求。纳米金因其比表面积大、生物兼容性好及表面自由能高,已在生物试剂的固定化及免疫分析等领域得到广泛应用。 本文设计了一种以纳米金为载体固定蛋白质的新方法。纳米金和蛋白质形成的生物复合材料被成功地固定在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)片和聚苯乙烯微孔板上。蛋白质可被高密度地固定在固相载体上并较好地保留生物活性。基于以上设计,建立了利用CL成像检测H_2O_2及重组人白介素-6(rHu IL-6)的分析方法。本方法的线性范围和包被效率与直接固定蛋白的CL成像分析相比,都有显著提高。在选定的实验条件下,CL强度与H_2O_2浓度在1.0×10~(-6)~1.0×10~(-4)mol/L呈线性关系,与rHu IL-6浓度在2.0~312.0 pg/mL呈线性关系,检测H_2O_2的检出限为2.0×10~(-7)mol/L(3s),rHu IL-6的检出限为0.5pg/mL,对3.0×10~(-5) mol/L的H_2O_26次测定结果的R.S.D.为3.8%,对39.0 pg/mLrHu IL-6 6次测定结果的R.S.D.为4.4%。将本方法用于人血清中rHuIL-6的检测,结果令人满意。 (4)化学发光成像分析法检测人血清中的自介素6(rHuIL-6) 众所周知,鲁米诺CL体系的发光量子产率不超过5%,而双[2,4,6-三氯苯基】草酰酯(TCPO)=H_2O_2-荧光剂CL体系具有较高的发光量子产率,通常可达30%。本文建立了一种新的化学发光免疫分析(CUA)方法,结合了传统ELISA方法和双[2,4,6-三氯苯基]草酰酯(TCPO)-H_2O_2CL体系的优点。邻苯二胺(OPDA)与H_2O_2在HRP催化下反应生成荧光物质2,3-二氨基吩嗪(DAPN)。DAPN被TCPO和H_2O_2反应的中间产物激发产生CL信号,本文研究了所产生的CL信号强度与抗原浓度间的关系。作为方法的分析应用,将本方法用于检测rHuIL-6.在最优化的实验条件下,CL强度与rHu IL-6浓度在4.0~625.0 pg/mL呈线性关系,检测rHu IL-6的检出限为0.5 pg/mL,检测78.0 pr/mL rHu IL-6的R.S.D.为2.3%,将本方法用于测定人血清中rHu IL-6,结果令人满意。 (5)化学发光成像分析法检测β-人绒毛膜促性腺激素(β-HCG) 本文采用一种灵敏、简单的方法,可实现对β-HCG的高通量检测。本法具有ELISA方法的特异性、双[2,4,6-三氯苯基]草酰酯(TCPO)-H_2O_2 CL体系的高灵敏度及CL成像分析高样品通量等优点。邻苯二胺(OPDA)与H_2O_2在HRP催化下反应生成荧光物质2,3-二氨基吩嗪(DAPN)。DAPN被TCPO和H_2O_2反应的中间产物激发产生CL信号,本文研究了所产生的CL信号强度与抗原浓度间的关系。作为方法的分析应用,将本方法用于检测β-HCG。在最优化的实验条件下,CL强度与β-HCG浓度在12.5~400.0 mIU/mL呈线性关系,检测β-HCG的检出限为3 mIU/mL,对50.0 mIU/mLβ-HCG 9次平行测定结果的R.S.D.为3.9%。将本方法用于测定尿液中β-HCG的含量,结果令人满意。 3自发电池激发的电化学发光成像分析 电化学发光(Electrogenerated chemiluminescence,ECL)也称电致化学发光,是电化学反应过程中产生的激发态分子返回基态产生的光辐射,已成为分析化学中重要且有价值的检测方法。目前,文献报道的ECL分析都是使用外加的电源来实现ECL的激发,这就限制了ECL检测系统的微型化。及其在微全分析系统中的进一步应用。我们设想能否不使用任何外加电源便可实现ECL的激发?我们曾经设计了微型自发原电池为鲁米诺体系及钙黄绿素的电化学发光提供激发电位。大大的简化了ECL的设备,在ECL系统的微型化方面,迈出了新的步伐。金属Al,Zn,Cr,Cd等可作为阳极,Cu,Ag,Au,Pt及石墨等可作为电池的阴极。最后选择Al作为自发原电池的阳极,Ag作为阴极。可通过改变流动试剂的组成或用其他金属替换Al和Ag电极对调节电池的电位。在后续的工作中,进一步研究了Cu/zn合金形成的自发原电池。Cu/Zn合金自发原电池可以为鲁米诺电化学发光提供稳定的电位,将Cu/zn合金颗粒单独置于96孔板中形成自发电池传感器阵列,并利用鲁米诺/H_2O_2CL,体系验证传感器的性能。 自发电池传感器阵列具备以下几个优点:首先,不需要为ECL的产生提供外加电源,这有利于仪器的简单化及ECL检测在微阵列中的应用。其次,因为这些传感器利用廉价的仪器很容易制备,可实现传感器的低成本制作。再次,Cu/Zn合金传感器贮备方便,有效使用寿命大于100h。为了形成可任意使用的传感器阵列,使用了酶标板。 (1)自发电池激发的电化学发光传感器的研究及应用 研究了一种新型的电化学发光(ECL)成像阵列传感器并将其用于H_2O_2的测定。此传感器基于Cu/zn合金自发电池产生的ECL。在碱性溶液中,Cu/Zn合金由于金属腐蚀效应形成自发电池,此电池可为鲁米诺的ECL的产生提供稳定的电位,产生的弱的ECL信号可被H_2O_2增敏。将Cu/Zn合金的颗粒置于96孔板的微孔中形成自发电池传感器阵列。相对ECL强度与H_2O_2浓度在1.0×10~(-6)~1.0×10~(-4)mol/L范围内呈线性关系,检出限为3.0×10~(-7)mol/L(3s),对1.0×10~(-5)mol/L的H_2O_2进行11次平行测定,相对标准偏差(R.S.D.)为4.0%。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:O657.3

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