收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

RNAi介导的Lcy基因沉默对番茄果实中番茄红素含量的影响

万群  
【摘要】: 番茄红素(Lycopene)是植物中的一种天然色素,属于类胡萝卜素中的一种,它是许多类胡萝卜素生物合成的中间体,经过环化可形成其它类胡萝卜素。番茄红素主要存在于番茄、西瓜、红色葡萄柚等植物的果实,茶的叶片以及萝卜、胡萝卜等植物的根部,其中以番茄果实中的番茄红素含量最高,其含量可达到3~14mg/100g。在成熟的番茄果实中,番茄红素悬浮遍布于果肉中。番茄红素是类胡萝卜素中活性最强的抗氧化剂,有延迟衰老的作用,可以预防和缓解多种疾病,且对人体没有任何毒副作用,故被认定为营养型保健食品。番茄红素在西方饮食中非常盛行,已被许多国家批准使用于食品、化装品和药品。因此,培育高番茄红素的番茄品种,是近年来国内外番茄品质育种拘热点。番茄红素在植物细胞中的合成是在质体和叶绿体中进行的,其生物合成的过程为:八氢番茄红素(Psy)在脱氢酶作用下依次脱氢生成六氢番茄红素、链孢红素和番茄红素。番茄红素在番茄红素环化酶(Lcy)的作用下转化为其它类胡萝卜素。如果通过RNAi抑制番茄果实中番茄红素β环化酶基因的表达,就可以阻止番茄红素降解,促进其积累,从而创造高番茄红素的转基因番茄新种质。 本实验从番茄基因组中分离了Pds启动子片段,通过农杆菌介导的方法将Pds-GUS基因导入番茄中,研究Pds启动子的表达特性;同时根据RNA聚合酶Ⅱ介导的RNA沉默(RdRP)原理,将番茄红素β环化酶基因(Lcy-β)片段通过一段内含子构建成dsRNA基因,并用具有果实特异性表达的Pds启动子调控该RNAi基因的表达,导入番茄后研究抑制Lcy基因表达对番茄果实中番茄红素含量的影响。该研究结果可为借助分子改良途径提高番茄果实的番茄红素含量奠定基础。 主要研究结果包括以下几个方面: 1.番茄Pds启动子的克隆与功能分析 根据GenBank中公布的番茄Pds启动子序列(U46919)设计特异引物,从番茄基因组中分离了长1790bp的Pds启动子序列,测序结果表明所分离的Pds启动子序列和GenBank中公布的一致。通过SalⅠ和BamHⅠ酶切将全长Pds启动子插入到pVCT-2020表达载体中,替换掉该载体中GUS基因的35S启动子,构建成携有Pds-GUS基因表达盒的植物基因表达载体。通过农杆菌介导的转基因方法将Pds-GUS基因转入番茄中,获得的转基因番茄的果实、叶片及根经X-Gluc染色5h,70%乙醇脱色后,显微镜下观察照相。结果表明Pds启动子具有果实特异性的特点。 2.番茄红素环化酶(Lcy)基因的DNA片段的克隆, 根据GenBank中公布的番茄红素β环化酶基因(Lcy-β)序列(X86452)设计特异引物,上游引物P166:CTATGGTGTTTGGGTGGATG,下游引物P167:GTGCTCGATGCAACTGGCTTCTCTA,通过PCR从番茄基因组中获得了长302bp的Lcy片段,测序结果表明与GenBank公布的一致。 3.果实特异性RNAi的植物表达载体的构建 通过SalⅠ酶切,补平,再用BamHⅠ酶切后连接,得到Lcy片段反向重复连接的中间克隆载体pMD-srLcy。将pMD-srLcy经BamHⅠ酶切,去磷酸化后与内含子连接,构建RNAi片段的中间克隆载体pMD-RNAi。pMD-RNAi经SalⅠ和Ecl136Ⅱ切下RNAi片段插入到pVCT2020载体中,构建成pVCT-RNAi表达载体。pMD-Pds经SalⅠ和EcoRⅠ切下Pds启动子后,将Pds片段插入到SalⅠ和EcoRⅠ酶切的pVCT-RNAi载体中,构建成pVCT-PdsRNki载体。构建成的pVCT-PdsRNAi表达载体经酶切鉴定,能获得正确的目的带,表明构建的载体正确。 4.番茄遗传转化再生体系的建立 番茄种子经肥皂水清洗2~3次,70%的乙醇消毒30s后,清水冲洗掉乙醇;然后在超净台上用10%的次氯酸钠消毒30min,灭菌水漂洗4次后,接种于1/2MS培养基上,暗培养2~3天,待番茄种子发芽后,于25℃,光照强度18001x,16h光/8h暗的光周期条件下培养直到子叶完全展开。切取番茄的子叶和下胚轴,分别接种到MS+1.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+3%蔗糖+6.5%琼脂的固体培养基上,比较子叶和下胚轴的芽分化能力,结果表明子叶的芽分化能力高于下胚轴。 将番茄子叶接种到MS附加不同浓度6-BA(1~3 mg/L)与IAA(0.1~0.3 mg/L)及6-BA(1~3 mg/L)与NAA(0.1~0.3 mg/L)组合的培养基上,筛选适宜芽分化的激素浓度及最佳组合。结果表明在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+3%蔗糖+6.5%琼脂的培养基上番茄子叶的芽诱导率最高,并且诱导芽所需要的时间最短,长出的芽最壮,因此本实验最终采月MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+3%蔗糖+6.5%琼脂组合的培养基来诱导番茄子叶发芽。设计不同浓度的IAA(0.2~0.5mg/L),观察不定芽生根的速度、数量及生根的质量,以确定适于番茄生根的最佳IAA浓度,结果显示幼苗在不同培养基中都能生根,其中以含0.4 mg/LIAA的培养基生根最快,一周后即出现大量不定根,根系比较壮。 为了测定外植体对Kan的敏感性,在筛选的最佳诱导培养基中,加入不同浓度的kan(0、10、20、30、40、50、60、70 mg/L)测定外植体的分化情况,每个浓度3次重复,每次重复20个外植体,接种观察不同浓度kan对番茄子叶分化抑制的效果。结果表明当在浓度为60 mg/L的培养基上,有少量愈伤组织形成,以后逐渐白化、死去,不能分化出芽;含40 mg/Lkan的培养基上多数外植体形成较多的愈伤组织,大部分可分化出绿芽,并且生长正常;因此本实验所用番茄材料适宜的筛选压为kan 50mg/L。 5.转基因番茄的获得 采用农杆菌介导法,将携带pVCT-PdsRNAi表达载体的新鲜的农杆菌菌液用液体MS培养基重悬后,浸染已经在分化培养基上预培养两天的番茄子叶,将经农杆菌浸染的外植体接种到芽诱导培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+30g/L蔗糖+琼脂6.5g/L)上28℃暗培养2d,然后将外植体转入抑菌培养基(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+30 g/L蔗糖+300mg/L羧卞青霉素Cb,pH 5.8)上培养7天,然后把抑菌培养7d后的外植体转移到选择培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+30g/L蔗糖+琼脂6.5g/L+50 mg/L kan+250 mg/L Cb,pH 5.8)上进行选择培养,培养条件为:温度26±2℃,光照时间16h/d,光照强度3,0001x。选择培养2周后,外植体的切口处逐渐分化出抗性不定芽,将这些抗性芽转入(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+糖30 g/L+琼脂6.5g/L+50 mg几kan+200 mg/L Cb. pH 5.8)新鲜选择培养基中继续进行选择培养,每两周换一次培养基,其间不断的降低Cb的浓度。待抗性苗长到3~4am以上时,从基部切下形成的不定芽,转入MS+0.4 mg/L IAA+30 g/L蔗糖+50 mg/L的Kan的培养基上生根,7~10d后开始长出不定根,等幼苗长到3~4片叶后,将生根后的植株开瓶炼苗3~5d,移栽到人工气候室中让其自然生长直到结果。 6.转基因植株的检测 通过抗性筛选,本实验共获得了7株转化再生植株,分别提取这7株植株的DNA进行PCR检测,反应体系同扩增Lcy片段一样,反应条件只由72℃延伸1min变为72℃延伸2min外,其他条件不变。其中5株扩增出了预期的条带,表明外源基因已经整合到了番茄基因组中,将鉴定为正确的转基因植株移栽到人工气候室中,让其自然生长直到结果,获得转基因番茄果实。在农杆菌浸染过程中,农杆菌太浓,在后来的培养中外植体容易褐化、坏死;农杆菌太稀获得的抗性植株的机会就减少,因此,应适当掌握农杆菌的浸染浓度,本实验结果认为农杆菌菌液浓度的OD值在0.3~0.6之间是最适合浸染番茄外植体的浓度,同时用液体MS培养基重悬农杆菌是很必要的,可以降低农杆菌对外植体的毒害,增加外植体的成活率。 7.转基因番茄中番茄红素含量的测定 收获转色期20天后的完全红熟的番茄果实每株两个,研磨成糊以后,每株称取10g番茄糊,加入适量的氯仿在35℃避光提取4小时,离心,转移下层液体至一新的50mL的离心管中,然后向番茄残渣中再加入适量氯仿重复抽提2次,最后用氯仿定容到50mL。将提取的番茄红素溶液迅速用U-1800型紫外分光光度计在502nm的波长下测定番茄红素含量,氯仿做参比,每个材料重复3次,测得一系列吸光度值,取平均值计算番茄红素含量。测定结果表明所获得的5株转基因番茄果实的番茄红素含量都比非转基因番茄果实中番茄红素高,转基因番茄中番茄红素的平均含量是对照的2.1倍,其中1号转基因番茄果实中番茄红素含量增加最多,是对照的2.6倍。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 ;番茄红素的保健功效[J];吉林蔬菜;2011年04期
2 邓书平;;番茄红素萃取优化工艺条件研究[J];安徽农业科学;2011年22期
3 黎亚;;让男人更加强壮的三种好营养[J];农村实用科技信息;2011年07期
4 卢晓娟;赵素华;周勇志;张厚双;曹杰;周金林;;亚洲璃眼蜱免疫抑制蛋白p36基因的RNA干扰研究[J];中国动物传染病学报;2011年03期
5 张传伟;宋述尧;赵春波;温涛;孙凯;;吉林省主栽品种番茄营养品质的分析与评价[J];吉林农业科学;2011年03期
6 胡薇;张玉静;;RNA干扰技术及其在马立克病端粒酶研究中的应用[J];黑龙江畜牧兽医;2011年15期
7 万小荣;莫爱琼;杨妙贤;余土元;;植物基因沉默机制研究进展[J];安徽农业科学;2011年17期
8 刘婷;秦国华;张建珍;马恩波;;东亚飞蝗谷胱甘肽S-转移酶RNA干扰效率研究[J];应用昆虫学报;2011年04期
9 邓清华;付世新;刘国文;刘磊;王建国;白鸽;朱晓岩;李慧萍;李小兵;王哲;;siRNA特异性抑制犊牛原代肝细胞SREBP-1c基因的表达[J];中国兽医学报;2011年07期
10 殷发强;刘鑫;何佳文;朱威;熊国玺;;番茄红素在9%氧气的氮气中的热裂解产物[J];烟草科技;2011年07期
11 万学闪;刘文革;阎志红;赵胜杰;何楠;刘鹏;代军委;;西瓜果实发育过程中番茄红素、瓜氨酸和V_C等功能物质含量的变化[J];中国农业科学;2011年13期
12 黄良宗;钟科阳;王淑敏;司兴奎;马春全;顾万军;;RNA干扰抑制猪繁殖与呼吸综合症病毒N基因表达及病毒复制[J];广东农业科学;2011年11期
13 钟翔;李兴美;李伟;黄雪新;张莉莉;王恬;;肠上皮细胞RNA干扰Hsp70基因转染条件的研究[J];生物技术通报;2011年09期
14 陈妮;左国伟;潘玥;赖国旗;杨根岭;向廷秀;韩建红;黄云;;小鼠CHD5基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定[J];西南大学学报(自然科学版);2011年08期
15 王卫锋;太帅帅;王鲁;刘贯山;李凤霞;高晓明;孙玉合;;烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化[J];中国烟草科学;2011年04期
16 张志泉;包晓玮;雒秋江;翟荣仙;;紫草素等8种植物提取物对体外Hela细胞增殖的影响[J];新疆农业大学学报;2011年03期
17 呼丽君;柴友荣;张建奎;姚永宏;;芸薹属DFR基因家族RNA干扰载体的构建[J];西南农业学报;2011年03期
18 王忠和;初莉娅;宋世庆;;水果中类胡萝卜素的生物学作用[J];中国园艺文摘;2011年04期
19 刘凤军;宋英;张国芹;李军;徐君;;几种生物农药对番茄灰霉病及果实品质的综合影响[J];上海农业科技;2011年04期
20 刘新建;陶刚;刘永翔;刘作易;;Dicer蛋白分子的进化与结构研究进展[J];贵州农业科学;2011年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张辉;于力;朱龙英;万延慧;朱为民;;Hair-pin RNA介导的番茄抗TYLCV效果初步研究[A];庆祝中国园艺学会创建80周年暨第11次全国会员代表大会论文摘要集[C];2009年
2 李艳;严明;;RNA干扰[A];第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2004年
3 闫虎斌;陆智明;;基于RNA干扰的植物抗病毒育种原理及研究进展[A];中国柑橘科技创新与产业发展战略论坛暨中国柑橘学会2007年年会论文集[C];2007年
4 赵午莉;邵荣光;;MR-1基因在白血病K562细胞中的功能研究[A];2009医学前沿论坛暨第十一届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2009年
5 陈始明;陶泽璋;肖伯奎;;RNA干扰hTERT基因抑制Hep-2细胞生长增殖的实验研究[A];湖北省抗癌协会头颈肿瘤专业委员会第四次学术会议资料汇编[C];2005年
6 潘燚;李伟雄;杨素清;曾子君;林映如;郭爱林;;siRNA抑制肺癌细胞DNA-PKcs的表达与放射敏感性的关系[A];中华医学会放射肿瘤治疗学分会六届二次暨中国抗癌协会肿瘤放疗专业委员会二届二次学术会议论文集[C];2009年
7 梁睿;罗庆;金先庆;;快速直视筛选结缔组织生长因子特异RNA干扰序列的研究[A];第八届全国儿童肿瘤学术会议论文汇编[C];2009年
8 韩之波;王晗;任贺;赵辉;刘拥军;韩忠朝;;RNA干扰沉默HIF-1α对人乳腺癌细胞功能的影响[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集[C];2006年
9 王子见;吴秀萍;邓洪宽;刘明远;;RNA干扰技术在动物寄生性线虫研究中的局限性[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会论文集[C];2009年
10 母连志;丁壮;丛彦龙;尹仁福;刘美;王昌庆;李少丽;邱蜜蜜;;靶向新城疫病毒P基因利用RNAi技术抑制其在鸡胚成纤维细胞上的复制[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(下册)[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 万群;RNAi介导的Lcy基因沉默对番茄果实中番茄红素含量的影响[D];西南大学;2007年
2 李恭会;shRNA阻抑前列腺癌细胞雄激素受体和hTERT基因表达的研究[D];浙江大学;2005年
3 魏军民;RNA干扰逆转肿瘤多药耐药的实验研究[D];山东大学;2005年
4 王晓龙;小鼠骨骼肌细胞SelW基因的RNA干扰研究[D];东北林业大学;2006年
5 王静;转化生长因子-β1基因沉默对人涎腺粘液表皮样癌Ms细胞生物学行为的影响[D];第四军医大学;2006年
6 张守峰;狂犬病病毒的RNA干扰研究[D];吉林大学;2007年
7 王鹏雁;口蹄疫病毒干扰RNA转基因小鼠模型的构建[D];石河子大学;2008年
8 谭兵;RNA干扰在体外、体内抑制TNF-α表达的实验研究[D];广州医学院;2008年
9 倪勤;shRNA表达框的快速制备及其在抗HBV相关研究中的应用[D];浙江大学;2004年
10 杨捷琳;腺样囊性癌高低转移细胞株基因表达差异性及B7-1、XAGE-1b与转移相关性研究[D];复旦大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王永生;发酵法生产番茄红素[D];北京化工大学;2003年
2 方景岩;番茄红素微胶囊的制备[D];大连理工大学;2005年
3 苏亚洲;番茄皮中番茄红素的提取分离及稳定性研究[D];新疆农业大学;2010年
4 李芳;番茄红素的提取技术及稳定性研究[D];新疆农业大学;2003年
5 张卫强;微波辐射提取番茄红素及其增强稳定性研究[D];天津科技大学;2002年
6 王见冬;生物法合成番茄红素的工艺研究[D];北京化工大学;2004年
7 李纪锁;番茄中番茄红素含量影响因素及遗传的初步研究[D];中国农业大学;2003年
8 王学武;天然番茄红素的提取工艺及稳定性研究[D];湖南农业大学;2001年
9 王燕燕;番茄红素的提取纯化工艺及稳定性研究[D];河北工业大学;2003年
10 冯晓梅;天然番茄红素提取工艺的研究[D];中国海洋大学;2003年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 徐铮奎;RNA干扰剂即将浮出市面[N];医药经济报;2004年
2 王迪;番茄红素市场活跃度不减[N];医药经济报;2009年
3 丁贝丽;番茄生吃也补番茄红素[N];医药养生保健报;2009年
4 张伦;番茄红素开发大有可为[N];中国化工报;2000年
5 辛桦;番茄红素可以降脂[N];福建科技报;2003年
6 湖南医大附二院 李玉玲;番茄红素功能不在营养上[N];健康报;2000年
7 李小诺;解说番茄红素[N];医药养生保健报;2007年
8 本报记者 张晔;番茄红素食用油真能增强免疫力吗?[N];科技日报;2008年
9 陆淘;保健食品市场看好 番茄红素开发前景[N];中国食品质量报;2009年
10 本报记者 韦绍锋;番茄红素欲掀“红色风暴”?[N];医药经济报;2004年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978