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《西南大学》 2007年
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利用家蚕几丁质酶Bmchi提高球孢白僵菌的毒力

郭书娟  
【摘要】: 昆虫病原真菌是一类重要的害虫生防微生物,在农、林以及卫生害虫的生物防治中显示了良好的应用前景。然而作为杀虫剂,昆虫病原真菌存在击倒害虫速度缓慢和防效不稳定等不足,在一定程度上限制了真菌杀虫剂的应用范围。研究表明,利用基因工程超量表达一个或多个毒力基因是提高菌株毒力的一条有效的途径,其关键是获得有效的目的基因。目前,可供菌株改良的毒力基因资源非常有限,主要来源于菌株自身。由于昆虫病原真菌侵染致病的分子机理研究相对滞后,从病原菌鉴定新的毒力基因进展缓慢。因此,尝试筛选其它物种来源的毒力基因以改良昆虫病原真菌的毒力,是一条值得探索的途径。 昆虫病原真菌在侵染宿主过程中产生一系列水解酶(如几丁质酶、蛋白酶等),降解昆虫体壁,促进菌丝穿透。而病原真菌的宿主昆虫在发育的关键时期,也产生几丁质酶参与体壁的降解,协助完成昆虫蜕皮等的发育过程。而且,昆虫几丁质酶仅在幼虫蜕皮、化蛹和羽化阶段才有表达。若昆虫不合适宜的产生几丁质酶可能会对其生长造成不利影响,如在饲料中添加昆虫几丁质酶造成了昆虫的死亡(Ding,1995)。这些研究结果启示我们,是否可以利用昆虫几丁质酶高效降解体壁的能力来改良昆虫病原真菌的毒力? 基于此,本文选择家蚕蜕皮过程中产生的几丁质酶(Bmchi)作为研究对象,尝试利用其改良昆虫病原真菌毒力。首先,利用酵母表达Bmchi基因和缺失了几丁质结合域的Bmchi△c基因,分析其酶学特性,进一步将两个基因转入球孢白僵菌组成性表达,分析它们对菌株毒力的影响,为利用昆虫来源的几丁质酶基因改良杀虫真菌毒力提供依据。 酶学特性分析表明,几丁质结合域对几丁质酶Bmchi的酶学性能有重要影响:(1)缺失几丁质结合域削弱了几丁质酶(Bmchi)对不溶性几丁质底物的结合能力,降低了几丁质酶降解几丁质底物的活性;(2)缺失几丁质结合域改变了几丁质酶(Bmchi)的最适反应的pH值和最适反应温度。如Bmchi的最适反应pH是8,最适反应温度为25℃,而Bmchi△c的最适反应pH值为7,最适反应温度为35℃;(3)缺失几丁质结合域降低了几丁质酶的热稳定性。在40℃分别处理15min和30min后,Bmchi的相对活性分别是Bmchi△c的1.6倍和2.2倍;在50℃处理60min后,Bmchi和Bmchi△c的相对活性则分别稳定在25%和14%左右。 分别将Bmchi基因和Bmchi△c基因转入球孢白僵菌组成性表达,以桃蚜为试虫,进行生物测定。结果表明,组成性表达几丁质酶Bmchi基因显著提高了菌株毒力,而组成性表达缺失了结合域的Bmchi基因对菌株毒力的影响并不明显。在1×10~7个/mL孢子浓度下,超量表达Bmchi的转化子对桃蚜的半致死时间(LT_(50))比野生菌株缩短了13.4%,而超量表达Bmchi△c的转化子的LT_(50)比野生菌株仅缩短了5.8%。处理138hr后,致死中浓度(LC_(50))计算结果发现,超量表达Bmchi转化子的LC_(50)(5.5×10~6个/mL)比野生菌株降低了76%,而超量表达Bmchi△c转化子的LC_(50)比野生菌株略有增加。 由此表明,组成性表达家蚕几丁质酶可显著提高球孢白僵菌菌株毒力,而且家蚕几丁质酶的几丁质结合域与基因的毒力密切相关。实验结果证明,通过合理设计利用昆虫几丁质酶基因提高昆虫病原真菌毒力的方法是可行的。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S476.1

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