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《西南大学》 2007年
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家蚕细胞凋亡相关基因BmIce的功能鉴定

肖阳  
【摘要】: 细胞凋亡是指在一定的生理和病理条件下,机体为维护内环境的稳定,发生的受基因控制的、自动有序的死亡方式,也称为程序性细胞死亡。细胞凋亡广泛存在于各种组织中,机体通过凋亡将衰老、畸变和能导致疾病的细胞清除。细胞凋亡由基因控制,其核心的分子机制首先在秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)中得到阐明。作为生物学、遗传学和发育生物学模式昆虫之一的家蚕,其细胞凋亡研究尚处于初始阶段。目前已在NCBI上登录克隆序列的家蚕细胞凋亡相关基因有:含Bcl-2家族同源域BH结构域的BmP109,凋亡抑制因子BmIap,生存因子途径中的BmCdc2,家蚕白介素转换酶BmIce和BmIce2,caspase活化的DNA酶抑制剂BmIead基因和30k蛋白中的6G1基因。其中BmIce在人类、果蝇和线虫等物种中同源基因的促凋亡功能已经得到实验验证,本研究旨在对BmIce基因在细胞凋亡中的功能进行鉴定。 本实验以zdIs5;unc76线虫为材料,将BmIce的ORF亚克隆至线虫表达载体pPD52-102,以研究BmICE对线虫细胞凋亡的影响,从而探索该基因在家蚕细胞凋亡过程中的作用。此外,利用家蚕全基因组芯片数据,分析了BmIce基因表达谱,并对BmIce基因在不同因子诱导下家蚕BmE-SWU1细胞中的表达量进行了荧光定量PCR分析,同时对不同表达量的BmIce基因对BmE-SWU1细胞凋亡的影响进行了Hoechst核染观察。 实验主要结果如下: 1 BmIce基因全基因组芯片数据分析结果 BmIce在5龄3天不同组织中表达的芯片数据信息表明:BmIce基因在中肠中表达量最高,血液次之,表达量最低为马氏管;BmIce在不同时期表达的芯片数据信息表明:在家蚕幼虫5龄期间,BmIce基因表达量较高,上簇后伴随化蛹的生理发育过程,表达量逐渐降低,化蛾前一天表达量最低。 2 BmIce基因在线虫体内的凋亡功能检测 以pMD18-T-BmIce质粒为模板,使用BmICE primer1上、下游引物进行PCR扩增,将BmIce基因的完整ORF连接到pPD52-102载体,构建了pPD52-102-BmIce。用pPD52-102-BmIce质粒DNA注射zdIs5;unc76线虫,对照为pPD52-102空载体,以unc76作为标记DNA。对照和目的基因DNA注射浓度均为50ng/μl。注射pPD52-102-BmIce DNA后,在产生的F1代线虫中,四个线虫产生了F2。对这四个转基因系的PLM凋亡进行观察。结果表明四线虫系总平均凋亡率为30.05%;而注射对照的线虫产生的F2代其PLM细胞没有发生凋亡。对PLM细胞30%的杀死率表明BmIce为凋亡促进因子。 3 BmIce基因在家蚕BmE-SWU1细胞中的凋亡功能检测 为了进一步研究BmIce基因对家蚕细胞凋亡的影响,根据BmIce基因的cDNA序列设计荧光定量PCR引物,分别以作为对照的正常家蚕胚胎细胞BmE-SWU1,BmNPV感染12h的BmE-SWU1细胞和BmIce-Bacmid DNA转染12h的BmE-SWU1细胞cDNA为模板,以家蚕actin基因为内部参照,进行荧光定量PCR扩增。扩增结果表明,BmIce基因在感染BmNPV病毒后的BmE-SWU1细胞中表达量明显高于对照组,而BmIce-Bacmid DNA转染的BmE-SWU1细胞组又高于病毒感染细胞组。Hoechst核染结果显示:正常的BmE-SWU1细胞中,发出强荧光的凋亡小体少,胞质分布较均匀;BmNPV感染12h的BmE-SWU1细胞中,凋亡小体明显增加,表明随着BmIce表达量的增加,细胞凋亡的程度有所加深;BmIce-Bacmid DNA转染12h的BmE-SWU1大多数细胞中均可见明亮清晰的凋亡小体,表明随着BmIce表达量的进一步增加,细胞发生了更为严重的凋亡。 本实验的目的是对家蚕BmIce基因的细胞凋亡功能进行鉴定,为深入研究家蚕细胞凋亡机理奠定基础。对家蚕细胞凋亡相关基因功能的研究对揭示家蚕的发育生物学、遗传调控机制具有重要的理论意义,并能丰富家蚕作为模式生物的研究内容,对研究家蚕的生长发育、蚕病防治有着重要的意义,对蚕业科学的应用研究也有着指导作用。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q343

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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2 汲晨锋;芦笋多糖、芦笋皂苷抗肿瘤作用及机制研究[D];北京中医药大学;2010年
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【同被引文献】
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中国硕士学位论文全文数据库 前3条
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3 陈默;紫外线诱导家蚕卵巢细胞(BmN-SWU1)凋亡的研究[D];西南大学;2008年
【二级引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 郑桂玲;鳞翅目昆虫胚胎细胞系的建立和高蛋白表达细胞克隆株的研究[D];山东农业大学;2010年
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5 姜翠翠;木奈多酚氧化酶(PPO)基因启动子的克隆与功能鉴定[D];福建农林大学;2008年
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