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三个CTV弱毒分离株的拮抗效果研究

王志刚  
【摘要】: 由柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)引起的柑橘衰退病是世界范围内最具经济重要性的柑橘病害。应用弱毒系交叉保护(MSCP)是防治茎陷点型柑橘衰退病的有效方法之一。因此,研究CTV弱毒分离株对我国强毒株系的拮抗作用并对其效果进行评价,是筛选具有MSCP应用价值的CTV弱毒分离株的重要环节。本文通过CTV弱毒分离株对强毒分离株的拮抗试验,筛选出拮抗作用强的弱毒株系,可为我国应用MSCP防治柑橘衰退病的打下一定的基础。 本文首先对中国农科院柑橘研究所国家柑橘苗木脱毒中心收集的CTV弱毒分离株CT10、CT12、CT17和强毒分离株CT4的p20、p23、p25三个基因RT-PCR产物进行HinfI/RFLP分析,其次对这三个基因测序后进行了酶切位点分析和同源性分析,同时应用四对引物对供试毒源基因组5’基因片段进行RT-PCR分析,以达到区分强、弱毒分离株系的目的。应用上述方法结合茎陷点症状分析,对3个CTV弱毒分离株与强毒分离株CT4之间的拮抗效果进行了评估。此外,还比较了9个保存在新会橙上的CTV分离株嫁接接种到凤凰柚前后p25基因的HinfⅠRFLP和SSCP变化情况。研究结果如下: 1)通过酶切发现CTV强毒分离株CT4是以p25 HinfⅠRFLP第Ⅲ组群为主的p25/HinfⅠRFLP第Ⅰ、第Ⅲ组群的混合株系,弱毒分离株CT17与弱毒分离株CT12均属p25/HinfⅠRFLP第Ⅰ组群,弱毒分离株CT10属p25/HinfⅠRFLP第Ⅳ组群。对p20基因的HinfⅠRFLP分析表明,CT10不能被酶切;CT12、CT17的p20/HinfⅠRFLP谱带相同,均有约180bp、约370bp的DNA条带;CT4的酶切谱带具有约100bp、约180bp、约280bp、约370bp的4条DNA条带。 2)对供试的4个CTV分离株的p20、p23和p25基因序列同源性分析表明在CT10、CT12和CT17三个弱毒分离株中CT17与强毒分离株CT4同源性最高。 3)RT-PCR分析表明用引物T30 5’(f,r)和引物T30 K17(f,r)进行RT-PCR均可将CTV强毒分离株CT4与弱毒分离株CT17、CT12区分开。 4)通过本试验所建立的鉴别CTV强、弱毒株系的RFLP方法和其与RT-PCR相结合的方法,实现了对CT4强毒分离株的定期分子监控。 5)拮抗实验中对CTV强毒分离株CT4的分子监控表明,接种强毒分离株后1个月、3个月、5个月和8个月,CTV强毒分离株CT4的检出率在经弱毒分离株CT10接种的植株分别为25%、50%、87.5%和100%;在经CT12接种的植株分别为40%、50%、80%和80%;在经CT17接种的植株分别为9.1%、27.3%、35.4%和45.6%。三个CTV弱毒分离株均减少或延迟了强毒分离株CT4的检出,对CT4均表现一定拮抗作用,其中CT17的拮抗效果最好。茎陷点症状的分析结果与分子检测结果一致。 6)9个保存在新会橙上的CTV分离株嫁接接种到凤凰柚的p25基因的HinfⅠRFLP和SSCP变化情况的比较试验,结果表明有7个分离株RFLP组群发生变化,其中6个由混合组群变为单一组群;除分离株CT90接种前后的SSCP谱带保持不变外,其余8个分离株从新会橙接种到凤凰柚后,SSCP谱带数均减少。这一现象表明可能某些能在甜橙上增殖的CTV株系在凤凰柚上的增殖受到了抑制。


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