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《西南大学》 2007年
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喜树ipi基因的克隆鉴定及三分三托品烷类生物碱的代谢工程

潘夕春  
【摘要】: 植物来源的次生代谢物是天然产物中最大的一类化合物,这些小分子化合物往往是植物与环境间相互作用的结果。植物次生代谢物包含多种具有药用活性的成分,如抗肿瘤药物喜树碱和抗胆碱药物东莨菪碱。 异戊烯基焦磷酸异构酶(IPI)催化IPP和DMAPP之间的可逆反应,这两种5碳化合物是所有萜类化合物包括喜树碱在内的共同前体。为研究喜树碱生物合成的分子机理和为喜树碱代谢工程提供靶点;用RACE技术从喜树(Camptotheca acuminate)中克隆了ipi基因全长cDNA,并且对该基因进行了生物信息学分析、组织表达谱分析和功能验证。克隆的喜树ipi基因(GenBank(?)登录号:DQ839416;CaIPI)cDNA全长1143 bp,其长度为930 bp的开放阅读框(ORF)编码长度为309个氨基酸残基的IPI蛋白(CaIPI)。生物信息学分析显示CaIPI及其编码的蛋白与已知ipi基因和蛋白序列同源。CaIPI序列包含IPI蛋白典型的Cys-149位点和Glu-212位点,这两个氨基酸残基是IPI蛋白催化区域中最保守的位点。亚细胞定位预测CaIPI定位于质体,表明该蛋白属于MEP途径。将CaIPI与来源于植物、动物、真菌、藻类和细菌的IPIs构建分子发育树,结果表明IPIs在进化树上按照各自所属类群分为5枝,CaIPI聚到植物的一枝。利用半定量RT-PCR技术对CaIPI进行组织表达谱分析,结果表明CaIPI在茎中表达量最高,而嫩叶和根中次之;在成熟叶片和果实中则检测不到CaIPI的表达。对喜树各组织喜树碱含量进行HPLC检测,表明在嫩叶中喜树碱含量最高,在果实和根中次之,这与CaIPI组织表达谱分析的结果不符。该结果提示喜树碱储藏过程中存在转运机制,是对前人相关研究的补充。用CaIPI的ORF序列替换pTrcAtIPI质粒上的拟南芥ipi基因编码区,获得pTrcCaIPI质粒;在大肠杆菌XLl-Blue中导入pAC-BETA质粒,重建了其β-胡萝卜素合成途径;再将pTrcCaIPI转入该菌获得XLl-Blue+pAC-BETA+pTrcCaIPI。该菌在颜色互补平板上菌落呈现明亮的橘黄色。结果表明,该菌中CaIPI的超量表达能推动萜类代谢流向β-胡萝卜素合成的方向流动,证实CaIPI具有典型ipi基因的功能。对CaIPI的克隆分析和功能鉴定研究,有助于在分子遗传学水平上了解CaIPI的功能,并对研究喜树碱前体合成的分子机理有一定帮助。 托品烷类生物碱(TAs)是一类提取自茄科植物的次生代谢物,常用的药用产物包括莨菪碱和东莨菪碱。两者尤其是东莨菪碱具有很强的抗胆碱作用,作为镇静剂和麻醉剂广泛应用于临床上。TAs生物合成起源于多胺代谢途径,途径中多个基因目前已经被克隆得到,使TAs途径的代谢工程修饰有了可能。PMT和H6H是催化TAs途径中的关键酶,目前已有报道证明这两个酶是TAs途径代谢工程的靶点。本研究选取TAs基源植物三分三(Anisodus acutangulus)作为植物材料,首先建立其无菌苗培养系统。用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)A4遗传转化三分三,建立了其遗传转化方法。对发根基因组进行rolB和rolC基因的PCR检测,阳性率达到100%。将携带烟草pmt和莨菪h6h的pXI质粒转入经过“解除武装”的根癌农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens)C58C1(携带pRiA4质粒),获得工程菌株C58C1-pXI。用C58C1-pXI遗传转化三分三,用100 mg·L~(-1)的卡那霉素进行抗性筛选,获得了抗性发根系。对发根基因组进行rolB、rolC、pmt和h6h基因的PCR检测,32%的C58C1-pXI转化发根系同时检测到4个基因,表明共转化率达到32%,实现了外源pmt和h6h在三分三发根中的高效表达。利用HPLC检测转基因发根系的莨菪碱和东莨菪碱含量,并与空白发根和自然根进行对比,验证转基因的效果。转基因组发根东莨菪碱含量最高达到3.702±0.341mg·g~(-1)dw,比A4转化发根系高出近6倍,比自然根高出近25倍;莨菪碱含量最高达到8.794±0.563 mg·g~(-1)dw,比A4转化发根系高出近8倍,比自然根高出近75倍;东莨菪碱和莨菪碱总量最高达到11.804mg·g~(-1)dw,比A4转化发根系高出近7倍,比自然根高出近44倍。本研究采用多基因共转化调控策略成功实现了三分三TAs途径的代谢工程,为开发TAs药源提供了新材料。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R91

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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【二级参考文献】
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