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《西南大学》 2007年
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木本曼陀罗毛状根诱导及其植株再生

杨雪清  
【摘要】: 生物碱(alkaloids)是分子结构中含有第2到第4氮原子的植物次生代谢产物,提供了许多具有药用活性的化合物。木本曼陀罗(Datura arborea L.)系茄科曼陀罗属,其叶和花含莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine),是莨菪烷类生物碱(Tropane alkaloids,TA)的资源植物。东莨菪碱是在临床上广泛使用的一种重要的基本药物,有解痉、镇痛、麻醉等药用功能,临床主要用于治疗麻痹症、晕动症、胃肠痉挛性绞痛、三叉神经痛等症,市场需求十分巨大。 本研究建立了木曼陀罗离体培养和基于木曼陀罗毛状根的遗传转化以及毛状根植株再生体系,为利用植物次生代谢工程技术实现木曼陀罗莨菪烷类生物碱的代谢工程及开展分子育种奠定了基础。 以木本曼陀罗的叶片为外植体,通过“一步法”获得丛生芽及其再生植株,建立了木本曼陀罗的快速无性繁殖体系。结果表明:木本曼陀罗最佳丛生芽诱导培养基为MS+6-BA3.0mg/L+NAA 0.2mg/L,丛生芽分化率可达91.4%,平均丛生芽倍增数为13.5。试管苗生根培养基以1/2MS+IBA 1.0mg/L最好,生根率高达94.5%。 用带有pRiA4质粒的“解除武装”(disarmed)的重组C58C1工程菌采取“叶盘法”转化木本曼陀罗无菌苗叶片,建立了基于木本曼陀罗毛状根的遗传转化体系,并且对遗传转化的条件进行了优化。实验结果表明:菌液OD值为0.6时,致根能力最强;对外植体进行预培养2d、外植体与菌液共培养3d时毛状根诱导率最高,达83.0%;将100μmol/L乙酰丁香酮(AS)同时加入转化菌液和共培养培养基中,毛状根诱导率最高,达到83.3%。 对rolB、rolC的PCR检测证实了发根型质粒pRiA4整合到木本曼陀罗毛状根基因组内。 通过高效液相色谱法(HPLC)检测木本曼陀罗毛状根及其再生植株中的生物碱含量,结果显示:毛状根中莨菪碱和东莨菪碱含量相对于野生植株的根和叶中的含量有了很大的提高。此结果有力地证明了通过发根农杆菌的遗传转化技术可以获取高产莨菪烷类生物碱的木本曼陀罗毛状根,具有非常重要的研究意义和商业价值。 将毛状根转入附加不同激素的培养基中诱导再生植株,并检测其中所含莨菪碱和东莨菪碱的含量。木本曼陀罗毛状根采用“一步法”诱导芽的适宜培养基为:MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L。“两步法”诱导芽的适宜条件为:MS+6-BA4.0mg/L+KT0.5mg/L+2, 4-D0.5mg/L为适宜毛状根的愈伤诱导培养基,芽诱导培养基为MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L。最适宜生根培养基为1/2MS+IBA0.1mg/L。HPLC检测结果表明毛状根再生植株中莨菪烷类生物碱的含量较野生植株有了很大的提高。 将毛状根再生植株移入盆中驯化栽培,一个月左右后,多数再生植株生长成为健壮木本曼陀罗苗,很好的存活下来。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q943.1

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