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《西南大学》 2007年
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重组表达稻瘟菌激发子对水稻油菜生长和抗性的影响

姚庆  
【摘要】: 激发子作为一类对病原菌无直接毒杀作用却可诱导植物产生多重防御反应的化合物,在植物病虫害生物防治中具有重要应用前景。为了进一步挖掘天然条件下存在的激发子资源,研究从稻瘟菌(Magnaporthe griesea)中分离纯化出提高水稻和油菜抗病和促进生长性能的蛋白激发子,就其诱导抗性的作用机理及差异表达蛋白进行了系列研究,结果如下: (1)从稻瘟菌的粗提物中纯化了稻瘟菌激发子,用从稻瘟菌中分离到的激发子注射兔子,得到了激发子的抗体。同时用LC-ESI-MS/MS对其进氨基酸测序。用稻瘟菌总cDNA作模板通过PCR得到这个基因。这个基因被命名为pemg1(Protein Elicitor from Magnaporthe griesea).本研究把pemg1基因连入pET28a载体的EcoRⅠ和XhoⅠ位点进行原核表达。重组的稻瘟菌激发子蛋白(His_6-PEMG1p)的表达量约占总蛋白量的7%,通过Mag His Extraction kit用磁珠法纯化His_6-PEMG1p,结果在12%SDS-PAGE上得到了均一的42kD的单带。我们通过western-Blotting证明,42kD的His_6-PEMG1p与天然提取的稻瘟菌激发子具有相同的抗原性,这证明了表达和纯化的成功。 (2)用纯化的10ug.m~(-1)的His_6-PEMG1p处理水稻,研究了四个与防御相关的基因对His_6-PEMG1p处理的应答。RT-PCR的结果表明:用His_6-PEMG1p处理,可以提高stkm,fad,pbz1,pr1基因的表达。同时研究还发现His_6-PEMG1p处理以后,能显著提高水稻POD和PAL等防御相关酶的活性,在处理以后后第4h时。本研究还证明,叶面喷施His_6-PEMG1p后,水稻对稻瘟菌的抗性有明显提高,分别在第14d和第21d的防治效果分别为46.7%和37.23%。用双向电泳分析表明用His_6-PEMG1p处理以后在水稻叶片上找到了14个蛋白(斑点)表达上调。这说明His_6-PEMG1p能够引起水稻叶片蛋白的表达变化。 (3)本研究用His_6-PEMG1p对油菜种子浸种,发现了在能够促进油菜的种子的萌发,能够提高发芽率10.5%。发芽的种子长势整齐,根系活力比对照平均高出38.7%,茎长比对照高出48.1%。本研究还证明了了His_6-PEMG1p能诱导油菜对菌核病的抗性。在离体叶片上接种油菜菌核病,接种后第2d,第3d,第4d的病斑直径分别为0.92cm,1.52cm,1.90cm,比同期对照的病斑直径都小,达到显著的水平。 (4)通过双向电泳,鉴定到了His_6-PEMG1p能够诱导油菜叶片中至少五个蛋白的上调表达,通过比较这五个蛋白的肽指纹图谱,这五个上调表达的蛋白分别:Peroxidase,Rubisco,Myrosinase,Malate dehydrogenase,和一个未知蛋白。因此,His_6-PEMG1p对油菜的影响可能是诱导了油菜生长和防御相关酶的活性,从而加速了油菜的三羧酸循环,提高油菜光合用速率和油菜对有害生物的防御能力。 稻瘟菌激发子作为一种生物活性的蛋白质,具有促进植物生长和诱导植物抗性的作用。本研究报道了纯化稻瘟菌激发子的技术路线和从稻瘟菌克隆出稻瘟菌激发子的基因。为研究植物和病原物的交互作物和开发激发子的潜力提供依据和基础。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S511;S565.4

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