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《西南大学》 2008年
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钙调磷酸酶对球孢白僵菌生物学特性影响

吴迪  
【摘要】: 昆虫病原真菌是自然界控制害虫的重要因素之一,在害虫生物防治中具有广阔的应用前景。但是作为一类重要的生防剂,昆虫病原真菌自身也存在击倒害虫时间过长和防效不稳定等缺点,使得其广泛使用受到限制。主要原因在于,人们对昆虫病原真菌侵染致病的分子机理研究较为薄弱,在实际应用中缺乏系统的理论指导。因此,加强昆虫病原真菌侵染致病的分子机理研究,对促进真菌杀虫剂产业具有重要意义。 钙调磷酸酶(Calicineurin,CN)是一种高度保守的Ser/Thr蛋白磷酸酶,其氨基酸序列从酵母到人类均具有较高的同源性。目前,钙调磷酸酶被认为是生物体应激反应时的中心调节蛋白,并与真菌的孢子及菌丝形态、调节细胞内阳离子平衡平衡、细胞壁的合成以及病原真菌致病性等相关。因此,钙调磷酸酶介导的信号途径是揭示真菌相关生物学性状分子机理的重要线索。然而,钙调磷酸酶在昆虫病原真菌中的功能,目前尚无相关报道。 本论文以国内外广泛用于害虫生物防治的昆虫病原真菌球孢白僵菌(Beauveria bassiana)为材料,利用同源克隆分离了与构巢曲霉、稻瘟病菌钙调磷酸酶催化A亚基编码基因CNA同源基因BCNA,并通过超量表达和反义抑制BCNA研究了钙调磷酸酶与球孢白僵菌发育分化、侵染致病以及逆境适应性调节等的关系,为探讨钙调磷酸酶在昆虫病原真菌球孢白僵菌中的生物学功能奠定基础。 1.CNA同源基因BCNA的克隆与特征分析 在分析多种丝状真菌CNA同源蛋白保守氨基酸序列的基础上,通过简并PCR和YADE等方法,从球孢白僵菌中克隆得到一个CNA编码基因,命名为BCNA(GenBank登录号:EU386769)。通过3′RACE克隆了BCNA的cDNA序列。序列分析表明,BCNA含有3个内含子,编码525个氨基酸,推测分子量为60 kDa,等电点为6.04。BCNA推测氨基酸序列与来源于禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)等CNA高度同源,相似性分别为87%、87%、85%和82%,并且具有保守的钙调磷酸酶B亚基(调节亚基)结合域、钙调素结合域以及自抑制区域。Southern杂交显示,BCNA基因在球孢白僵菌中以单拷贝形式存在。 2.BCNA基因的表达分析 利用Real-Time RT-PCR分析了BCNA基因的表达特性。结果显示,球孢白僵菌在高温(32℃)、高渗(0.5 M NaCl)以及昆虫体壁诱导条件下,BCNA表达水平均明显升高,且表达水平随诱导时间的变化趋势存在差异。在昆虫体壁为唯一营养源的培养基中诱导培养12hr的BCNA表达水平最高。由此推测,BCNA可能参与病原菌的逆境适应性调节,并且与球孢白僵菌寄生生长相关。 3.BCNA基因的功能分析 为进一步明确BCNA在球孢白僵菌中的生物学功能,利用超量表达和反义抑制BCNA基因,分析了BCNA与菌株发育分化、侵染致病以及逆境适应性调节等的关系。主要结果如下: BCNA对球孢白僵菌分生孢子的产生、活力以及菌落形态无明显影响。生物学特性分析表明,反义抑制和超量表达BCNA对球孢白僵菌产孢量、萌发率无显著影响。在正常培养条件,高渗(0.8 M NaCl)、酸性(pH 5.0)、碱性(pH 9.0)以及高温(32℃)等培养条件下,超量表达和反义抑制BCNA转化子菌落形态与野生菌株无明显差异。但在氧化环境(含0.05%H_2O_2的CZP)下,超量表达BCNA转化子菌落生长速率显著小于野生菌株,推测BCNA可能参与昆虫病原真菌球孢白僵菌对氧化环境的适应性调节。 BCNA影响球孢白僵菌对杀真菌剂咯菌腈的敏感性。研究表明,反义抑制BCNA降低了球孢白僵菌对杀真菌剂咯菌腈的敏感性,转化子对杀真菌剂咯菌腈产生明显抗性。超量表达BCNA的转化子和野生菌株相同,对咯菌腈敏感。由此表明,钙调磷酸酶信号途径参与球孢白僵菌对杀真菌剂咯菌腈敏感性调节。 BCNA影响球孢白僵菌致病性。生物测定表明,反义抑制BCNA降低了球孢白僵菌对桃蚜的毒力。在1×10~7孢子/ml浓度下,反义抑制BCNA的转化子对桃蚜的致死中时比野生菌株延长7.4 hr,而超量表达BCNA对球孢白僵菌毒力无明显差异。由此表明,BCNA对球孢白僵菌毒力有一定的影响。 BCNA影响球孢白僵菌昆虫体壁水解酶编码基因Pr1和疏水蛋白编码基因Hyd2的表达。RT-PCR结果显示,在昆虫体壁诱导条件下,反义抑制BCNA菌株的昆虫体壁水解酶编码基因Pr1表达水平在24 hr明显低于野生型菌株;在PDA上培养菌株18 d后发现,反义抑制BCNA菌株的疏水蛋白编码基因Hyd2表达水平也较野生型菌株明显降低。 本研究结果表明,BCNA参与昆虫病原真菌球孢白僵菌对氧化环境的适应性以及对咯菌腈的敏感性调节,并与球孢白僵菌的毒力密切相关。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S476.1

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