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《西南大学》 2008年
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纳米微粒固载蛋白质肿瘤标志物电化学免疫传感器研究及其应用

唐点平  
【摘要】: 肿瘤标志物是肿瘤细胞本身存在或分泌的特异性物质,迄今所知的肿瘤标志物中,绝大多数不但存在于恶性肿瘤中,而且也存在于良性肿瘤、胚胎组织,甚至正常组织中。因此,这些肿瘤标志物并非恶性肿瘤的特异性产物,但在恶性肿瘤患者中明显增多。肿瘤的预防、诊断和治疗是目前医学领域研究的重大课题。在肿瘤的发生和发展过程中,细胞因子及其受体在细胞信号转导和细胞的增殖和分化过程中也起着重要作用。肿瘤细胞的快速增殖必然引起细胞因子及其受体表达和分布的变化,这种变化必然引起免疫相关因子在肿瘤免疫过程中发生量的变化,肿瘤表面抗原是研究进展较快的指标。 免疫传感分析是利用抗原.抗体特异性反应来测定痕量物质的一种高灵敏度、高选择性的方法,该方法的提出和发展不仅推动了血清学的应用,而且也有助于从理论上研究抗原-抗体的关系及其本质。纳米生物技术是纳米技术与生物技术交叉渗透形成的新技术,是纳米技术的重要组成部分,也是将来生物医学领域中的一个重要发展方向。纳米材料的介入为免疫分析的发展提供了无穷的想象空间,由于其量子尺寸效应和表面效应,可把免疫分析方法的性能提高到新的水平,使其不仅检测的速度快、精度高、可靠性好,还能实现多功能化和选择检测。本论文采用不同技术、不同方法制备一系列不同纳米材料(如:纳米金、银、二氧化硅,核—壳复合纳米,磁性纳米,磁性复合纳米,磁性纳米水胶等),并结合电分析化学方法、石英微天平、紫外、红外、拉曼、表面等离子等技术,将其用人体内肿瘤标志物(如:CEA,CA 125,CA 15-3等)的检测,实现将生物传感与化学生物学、生物化学、电磁物理学、临床医学相结合,研制新一代免疫传感器,方法较传统的ELISA和放射性免疫分析(RIA)简单、快速,可望作为一种临床诊断分析的工具。本论文主要包括下面几个部分: 第一部分:综述。纳米电化学及微纳结构电化学生物传感的设计和应用已成为目前电化学生物传感器研究的重点。单分子/细胞分析和生物印迹生物传感由于它们良好的发展态势以及在生命科学研究中的重要位置即将成为生物传感发展的主流,并逐渐向实时一在线、微阵列生物传感器发展,这种与信息技术相结合的新产业链必将成为生物技术发展的数字工程,并逐步实现生物传感与生物信息学、生物芯片、生物控制论、仿生学、生物计算机相结合。 第二部分:纳米金修饰免疫传感器对肿瘤标志物检测新方法研究。纳米金除了具有量子效应、表面效应、宏观量子隧道效应等特性外,还具有特殊的氧化-还原能力、特殊的光学性质、独特的生物兼容性,一般蛋白质在纳米金粒子上可保留一定的生物活性。此外,在生命科学领域中的一些生物大分子本身的尺寸就达纳米数量级,具有生物活性的蛋白质、酶、抗生素、超分子化合物等,常具有一些自组装、自修复和识别的性质。 (一)利用自组装和静电吸附技术相结合,将抗体分子固定在{nanogold/Co(bpy)_3~(3+)}_n多层复合膜修饰的铂电极表面,制备出用于检测乙肝表面抗原电流型和电位型免疫传感器。通过交流阻抗技术和循环伏安法对电极的制备过程和实验条件进行了优化,并对该免疫传感器的作用机理及性能进行了详细的研究。样品中乙肝表面抗原的浓度对电流和电位的响应在0.05-4.5μg/mL呈现出良好的线性关系,检测限为0.015μg/mL(3δ)。实验结果表明,该方法提高了抗体的固定量,增强了传感器的灵敏度,且该传感器响应迅速快、选择性好,血清中常见抗原基本不干扰测定,将其用于临床血清检验,与酶联免疫测定法(ELISA)的符合率为87.3%。 (二)将纳米金和硫瑾掺杂到石墨碳粉中,制得纳米金和硫瑾修饰的碳糊电极,在恒电位下将其进行活化,使硫瑾、纳米金、石墨碳粉交织在一起,防止硫瑾和纳米金的泄漏,然后通过电极表面的纳米金颗粒将癌抗体125(anti-CA 125)固定到碳糊电极表面,制得CA 125电流型免疫传感器。红外吸收光谱和紫外吸收光谱技术为电极的制备过程进行了表征。在优化的条件下,该免疫传感器的电流响应与样品溶液中CA 125的浓度保持良好的线性关系,线性范围为10-30U/mL,检测限为1.8U/mL(3δ)。 (三)通过恒电位方法将纳米金颗粒沉积到玻碳电极表面,然后将生物兼容性极强的鲫鱼红细胞固定在纳米金颗粒表面,用于第二层纳米金颗粒的吸附,最后将乳腺癌抗体(anti-CA15-3)固定在第二层纳米金颗粒上,制得电流型CA 15-3免疫传感器。通过原子力显微镜和石英微天平技术考察了该免疫传感器的制备过程,使用竞争性酶联免疫分析方法对样品中CA15-3进行了检测。在优化的条件下,该免疫传感器的电流响应与样品中CA 15-3的浓度在2.5-120 U/mL呈线性关系,检测限为0.5 U/mL(3δ),电极的相关系数为0.998。 第三部分:磁性纳米修饰免疫传感器对肿瘤标志物检测新方法研究。磁性纳米粒子是一种新型的纳米材料,可应用于各种生物活性物质如蛋白质的富集和分离、药物的磁靶向以及疾病的诊断和治疗等许多领域。由于磁性纳米粒子有着独特的化学和物理性能,已经成功的应用到磁控生物传感器中,并显著提高了生物传感器检测的灵敏度,缩短了生化反应的时间和提高检测的通量,为生物传感器领域开辟了广阔的前景。 (一)通过共沉淀法和化学还原法制备得到磁性壳一核型复合纳米Fe_3O_4/Ag颗粒,利用纳米银与生物分子的相互作用将肿瘤标志物癌胚抗体anti-CEA固定到复合纳米颗粒的表面,然后通过(自制)磁性碳糊电极将抗体功能化的磁性纳米颗粒吸附到电极表面,制得电位型CEA免疫传感器。通过TEM、AFM和FT-IR技术考擦了磁性纳米和生物磁性纳米的制备过程。在优化的条件下,该免疫传感器的电位响应与CEA的浓度在1.5—200 ng/mL呈线性关系,检测限为0.5 ng/mL(3δ)。 (二)通过高温燃烧法和反相微乳液法制得磁性壳—核型CoFe_2O_4/SiO_2复合纳米颗粒,利用纳米SiO_2的强吸附效应将乳腺癌抗体anti-CA 15-3固定在纳米颗粒表面,在外加磁场的作用下,抗体功能化的磁性复合纳米被吸附到工作电极的表面,通过石英微天平技术考察了该免疫传感器对溶液中的CA 15-3抗原的QCM响应情况,线性范围为10-180 U/mL,检测限为1.5 U/mL(3δ)。 (三)将四种不同的肿瘤标志物抗体(anti-AFP,anti-CEA,anti-CA 125,anti-CA 15-3)修饰到磁性复合纳米NiFe_2O_4/SiO_2颗粒的表面,在外加磁场作用下,分别固定在自制的微流检测池的工作电极上(该检测池包括五个工作电极和一个参比电极,在每个工作电极的后面放有一个外加磁铁),通过电位仪实现对四种肿瘤标志物的同时检测,检测限低于0.5μg/L(或kunits/L)。 第四部分:金磁纳米球修饰免疫传感器对肿瘤标志物检测新方法研究。在电化学免疫分析中,背景信号的减少,响应信号的增大是提高电化学免疫分析方法的另一重要途径。结合磁性纳米的物理特性和金纳米颗粒的表面优点,将生物分子固载在金磁纳米微球上,不仅增加了生物分子在基体表面地固定量,而且缩短了免疫传感器地制备时间。 (一)本文利用化学共沉淀技术和柠檬酸还原法分别制得纳米级Fe_3O_4和Au纳米颗粒,通过双功能试剂3—巯丙基三乙氧基硅烷将Au纳米键合到Fe_3O_4纳米颗粒表面,制得核壳金磁复合纳米,并运用金纳米颗粒的表面特性将乳腺癌抗体anti-CA 15-3固定在磁性复合纳米颗粒上。在外加磁场的作用下,抗体功能化的磁性复合纳米被吸附到自制的磁性碳糊电极表面,实现抗原.抗体实时、在线的检测。 (二)首先利用反相微乳液法制备得到硫瑾掺杂的磁性金纳米微球,然后将辣根过氧化物酶标记的癌胚抗体吸附在金磁纳米微球上,作为第二抗体的标记。以癌胚抗原为模型,硫瑾掺杂金磁复合纳米球为标记,辣根过氧化物酶为增强剂,将癌胚抗体anti-CEA固定在蛋白A和纳米金修饰的碳纤维电极上,利用夹心免疫分析法实现对人体内肿瘤标志物癌胚抗原CEA的检测。在优化的条件下,该免疫传感器对溶液中过氧化氢的还原电流随样品溶液中抗原的浓度的增大而增大,在没有辣根过氧化物酶作为增强剂时,该免疫传感器对癌胚抗原的线性范围为1.2-125 ng/mL;在辣根过氧化物酶作为增强剂的条件下,其线性范围为0.01-160ng/mL。同时,该免疫传感器呈现出良好的重现性和稳定性,将其用于人体血清样品的检测,和ELISA相比,回归方程的斜率为0.9628。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:TP212.3

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