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《西南大学》 2010年
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嗜卷书虱羧酸酯酶生化毒理学特性及其mRNA表达水平研究

周安韦  
【摘要】: 羧酸酯酶(Carboxylesterase, CarE)是昆虫体内一类水解内源性和外源性物质的解毒酶系,在昆虫对有机磷杀虫剂抗性中起着极为重要的作用,在对氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性中亦有一定的作用。本学位论文以广泛存在于多种储藏物中的害虫嗜卷书虱Liposcelis bostrychophila Badonnel为研究对象,测定了其对9种分别属于有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感性以及3种增效剂(DEF、TPP和DEM)的增效作用,并在此基础上,对该虫CarE的生化毒理学特性以及2个CarE基因在mRNA水平的表达进行了研究。主要研究结果如下: 采用药膜法测定了9种常用杀虫剂对嗜卷书虱的触杀毒力。结果表明,使用的5种有机磷类杀虫剂均对嗜卷书虱具有较高的触杀毒力,依次为甲基对氧磷毒死蜱马拉硫磷乙基对氧磷氧乐果。其中,甲基对氧磷和乙基对氧磷的毒力相差在3倍以上。在供试的2种氨基甲酸酯类杀虫剂中,涕灭威的触杀毒力显著高于残杀威,且高于其余供试杀虫剂。而2种拟除虫菊酯类杀虫剂的触杀毒力均显著低于其它7种供试杀虫剂,但具有较好的击倒作用。综合分析9种常用杀虫剂单剂对嗜卷书虱的触杀毒力发现,有机磷类杀虫剂对嗜卷书虱有较好的防治效果。因此在进行书虱防治时,有机磷类杀虫剂是比较理想的储粮保护剂。 增效作用测定结果表明,DEF对毒死蜱、马拉硫磷以及涕灭威具有较强的增效作用(增效倍数分别为7.50、5.90及3.86),其次,DEF对氧乐果、甲基对氧磷、乙基对氧磷及甲氰菊酯具有一定的增效作用(增效倍数分别为2.19、2.15、1.64及1.43),而DEF对残杀威和溴氰菊酯均无显著增效作用。这暗示酯酶参与了除残杀威、溴氰菊酯外其它7种杀虫剂在嗜卷书虱体内的代谢,而且对毒死蜱、马拉硫磷以及涕灭威的代谢起着重要作用。此外,TPP除了对甲基对氧磷无显著增效作用外,对其余8种供试杀虫剂均有不同程度的增效作用,其中对涕灭威具有最强增效作用,增效倍数达6.75。这表明羧酸酯酶极有可能参与了除甲基对氧磷以外所有杀虫剂的代谢,并且对涕灭威的代谢起着主要作用。DEM对氧乐果、毒死蜱、残杀威及溴氰菊酯均无显著的增效作用,其中甚至对氧乐果具有负增效作用;而对其余4种杀虫剂具有一定的增效作用,但增效倍数均不高,其中对乙基对氧磷的增效作用相对最强为2.97倍。这说明GSTs参与了乙基对氧磷的代谢,而对其它杀虫剂的代谢贡献不大。此外,增效作用测定结果说明在实仓防治中,可以考虑将杀虫剂与增效剂合理搭配使用,以达到防治书虱的最佳效果。 采用微量滴度酶标板法分别测定了以a-NA、β-NA为底物时嗜卷书虱CarE的生化毒理学特性(CarE活性、酶动力学参数、酶促反应的理论最适温度和最适pH值以及9种常用杀虫剂的离体抑制作用)。结果表明,以a-NA为底物时,嗜卷书虱CarE酶促反应的理论最适温度为24.9℃、最适pH值为6.5;以β-NA作为底物时,其最适温度为25.2℃、最适pH值6.2。从9种杀虫剂对嗜卷书虱CarE的抑制中浓度来看,以a-NA或p-NA作为底物时,甲基对氧磷和乙基对氧磷均能高效抑制其活性。其中,与β-NA作为底物相比,当α-NA作为底物时甲基对氧磷和乙基对氧磷的抑制作用则更强。然而,α-NA或β-NA作为底物,溴氰菊酯和甲氰菊酯对嗜卷书虱CarE均无明显的抑制作用。当α-NA为底物时,其余5种杀虫剂也体现出较好的抑制作用,依次为马拉硫磷氧乐果残杀威涕灭威毒死蜱。当β-NA为底物时,上述5种杀虫剂对嗜卷书虱CarE的抑制作用依次为马拉硫磷毒死蜱氧乐果残杀威涕灭威。结果同样说明书虱CarE普遍对有机磷类杀虫剂敏感,对拟除虫菊酯类不敏感。动力学参数测定结果表明嗜卷书虱羧酸酯酶对β-NA的亲和力高于对α-NA。此外,研究发现马拉硫磷、氧乐果、甲基对氧磷、乙基对氧磷、毒死蜱、涕灭威和残杀威等7种杀虫剂均可增强嗜卷书虱CarE对a-NA、β-NA两种底物的亲和力,并降低其催化底物的能力。 根据生物测定结果,分析了嗜卷书虱经9种常用杀虫剂处理30分钟后,其体内CarE活性变化的时间动态(处理后6、12、24、36及48 h)。结果表明,分别以a-NA、β-NA两种底物测得嗜卷书虱CarE的活性并无差异。随着马拉硫磷、氧乐果、甲基对氧磷、涕灭威处理嗜卷书虱后,CarE的活性随着时间的增长表现为先降低后升高,随后逐渐恢复至对照水平。在乙基对氧磷、毒死蜱、残杀威和甲氰菊酯处理后的不同时间,嗜卷书虱CarE的活性均受到抑制,其中,毒死蜱的抑制程度最高。在9种供试杀虫剂中,溴氰菊酯对嗜卷书虱CarE的活性没有显著的影响。此外,在活体条件下测定了9种常用杀虫剂对书虱羧酸酯酶动力学参数的影响,结果表明9种杀虫剂在活体条件下的影响不如离体条件下强烈。以α-NA为底物时,测得经马拉硫磷和毒死蜱处理后,嗜卷书虱CarE的Km和Vmax变化较大;而以β-NA为底物时,除乙基对氧磷和溴氰菊酯外,其它杀虫剂对该酶的Km和Vmax均有显著的影响。 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术研究了7种常用杀虫剂对嗜卷书虱酯酶同工酶谱的影响,电泳图谱分析结果表明,对照组嗜卷书虱酯酶同工酶共有8条谱带,且相对分子量大的酯酶谱带占据了很大比例。与对照相比,杀虫剂处理后嗜卷书虱酯酶同工酶的电泳条带颜色均变浅,说明其活性受到抑制而降低,且不同的杀虫剂对不同分子量的同工酶的抑制效果不同,表明这些不同分子量的酯酶在代谢不同的杀虫剂时作用不同。其中,甲基对氧磷和乙基对氧磷处理后,嗜卷书虱酯酶同工酶谱带几乎全部消失,表明嗜卷书虱的酯酶同工酶几乎都属于B-酯酶。 利用实时荧光定量PCR技术分析了我们在前期研究中克隆获得的两个嗜卷书虱CarE基因(Lb est1和Lb est2 GenBank登录号:EU854151和EU854152)经3种杀虫剂(溴氰菊酯、甲基对氧磷和涕灭威)诱导后其mRNA表达的时间动态(8、12、24、36及48 h)。结果表明Lbestl在甲基对氧磷、涕灭威以及溴氰菊酯处理后其mRNA的表达量均随时间出现先抑制再上升再恢复至对照水平,其中杀虫剂处理24 h后其表达量达最高峰,分别为对照的1.418倍、1.315倍及1.49倍。而在溴氰菊酯处理后,Lb est2 mRNA表达量也呈先抑制后上升再恢复的趋势,并在杀虫剂处理36 h后其表达量达最高峰达对照的1.48倍。在甲基对氧磷处理后,Lbest2 mRNA表达量在24 h后上升至最大值(为对照的1.47倍)随后逐渐回落至对照水平。涕灭威处理后,Lb est2 mRNA表达量均受到抑制低于对照。
【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S379.5

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